Maskens form säger en hel del om dig Marika Hellqvist Institutionen för Cell och Molekylär Biologi Göteborgs universitet På min institution studerar vi hur celler regleras. Hur vet tex en tarmcell att den skall se ut som den gör. Jag skall idag försöka introducera det system som jag använder för att studera dessa frågor nämligen en liten mask som Caenorhabditis elegans.

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2002 "for their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death" Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston 1/3 of the prize 1/3 of the prize 1/3 of the prize United Kingdom USA United Kingdom Massachusetts Institute The Wellcome Trust Sanger Institute The Molecular Sciences of Technology (MIT) Institute MA, USA Berkeley, CA, USA Cambridge, b. 1927 b. 1947 b. 1942 (in Union of South Africa) IDenna organism blev igår världsberömd eftersom Nobelpriset i fysiologi tilldeleades 3 maskforskare. Sydney som kallas masken far bestämde att detta var en utmärkt organism att använda, Horwits och Sulston har bidragit genom kartläggning av den och jag kommer tillbaka till mer exakt vad dom gjort lite senare.

Vad jag skall prata om idag Kort introduktion till ämnet molekylär biologi Presentation av C.elegans Mutanter och genetiska screener Har man hittat något kul då? Vad gör jag?

Den centrala dogmen i molekylär biologi brukar detta kallas Den centrala dogmen i molekylär biologi brukar detta kallas. I alla organismer finns DNA, hos mask och människa i den sk cell kärnan. Här finns information lagrad för att bygga upp hela den organism som DNA:t kommer ifrån. Detta skrivs av och blir till en mRNA molekyl som är en direkt avskrift av DNA och detta RNA transporterars sedan till en annan del av cellen där den fungerar som mall för ihop byggnaden av proteiner. Det viktiga att komma ihåg är att om man förändrar DNA så påverkar det hur proteinet kommer att se ut och om man har otur kan proteinet inte fungera.

Vild typ (N2 stam) ~1 mm Sett genom stereomikroskåp Så här der masken ut som vi tittar på den i laboratoriet i ett stereomikroskåp. Den är genomskinlig. Sett genom stereomikroskåp

Anatomin är enkel men tillräckligt komplex för att studera organutveckling och andra basala fenomen. Det finns hermafroditer och hanar. Hermafroditerna är honor som producerar egna spermier. Hermafroditer bär det befruktade ägget inne i gonaden till det består av ca 100 celler och då lägger hon ägg genom en öppning som kallas vulva.

C.elegans En 1mm lång fritt levande nematod... “Beskrivning” • ~ 50 timmars livscykel (ägg till ägg; hermaphrodite och hanar ca 1%) • Lätt att odla på plattor med E.coli vid 20oC • Går att frysa för långtids förvaring Presentera egenskaper som gör den användbar. Den har en kort livscykel eller generations tid. Det är bra när man vill studera genetiska effekter. Det kommer jag förklara lite mer längre fram. Man odlar masken på agar plattor i rumstemperatur. (Visa platta) . Man kan också frysa ner dom och sedan tina upp dom och tillräckligt många kommer att överleva. Mycket användbart då man kan förvara stammar som har en specifik förändring i decennier.

Mycket feromoner,lite mat C.elegans Livscykel vuxen Ägg L1 L2 L3 L4 Dauer Mycket feromoner,lite mat Bättre vilkor Hermafroditen lägger ett ägg som kläcks och sedan finns det 4 stycken larvstadier innan masken blir vuxen och kan lägga egna ägg. Om det finns lite mat kan masken gå in i ett sk sporstadie som kallas dauer och leva flera månader annars. Annars åldras och dör dom inom 3 veckor.

Vuxen Hermaphrodite Detta är en liten film hur masken ser ut när den kryper omkring

C.elegans En 1mm lång fritt levande nematod... “Beskrivning” • 959 celler (302 neuroner, 20 tarmceller Tex.) • Komplett cellinje kartlagd(från zygot till vuxen) Den färdiga masken består av 959 celler. Man har genom årets Nobelpristagare fått fram hela cellinje. DVs man vet vad varje cell från cell 1 till 959 gör. Detta gjordes genom att stirra i mikroskåp.

Den första celldelningen Här kan man se vad man har kallat cellerna och ungefär hur det ungefär ser ut i mikroskåpet. P0 är precis efter spermien har befruktat och sedan börjar celldelningen.

Ett cell-linje träd finns för alla 1090 celler som bildas i masken. Av dessa genomgår 131 programmerad cell död och kvar blir 959 stycken. Ett cellinje träd finns för alla don 1090 celler som bildas och här har jag hur MS cellen går vidare och delar sig och bildar bla muskler (bm) Men av dessa 1090 genogår 131 programmerad celldöd (x i trädet) och kvar blir 959 celler som bygger upp masken.

C.elegans En 1mm lång fritt levande nematod... “Beskrivning” • 100 Mb Genome, >99.9% sekvensat (6 kromosomer) människa ca 30xstörre • ~ 19 000 Gener (~ 5000 essentiella gener) människa ca 70 000 gener • “Power of Genetics” Hela genomet,DNA sekvensendvs vilken ordning baserna A,C,G och T kommer i är känd sedan 1998 och var det första djuret som blev sekvensat. Här bidrog framförallt John Sulston en av pristagarna. Som vi ser är det humana genomet mycket större men när man tittar på hur många gener det finns slås man av hur lika vi är människa har bara 3.5 gånger fler gener ungefär. Det humana genomet innehåller ocksa mycket sk skräp DNA som man idag inte vet vad eller om det har någon funktion. SPower of genetics, jag måste först förklara vad en mutation är

Mutanter vad är det? Mutation=förändring av genomet(DNA-kedjan) 3 klasser av mutationer: *spontana *inducerade (kemikalier, UV,röntgen,gamma strålning) *specifik (Knock-out) Ett sekvensat genom ger oss information om vilka proteiner som finns men inte vad dom gör. “Forward genetics” : man vill leta efter en intressant fenotyp tex tjock, problem att röra sig och ta reda på vilka gener som påverkar dessa fenotyper “Reverse genetics”: man utgår från ett protein som verkar intressant och man söker sedan efter djur med motsvarande gen muterad. Spontana det är sådana som sker utan att någon påverkar. Tex vid celldelning eller av normal UV-strålning från solen. Inducerade är sådana som man får fram genom att utsätta en organism för kemikaler, UV eller andra typper av strålning. Detta sker slumpmässigt. Specig är när man slår ut en gen specigkt kallas för Knock-out eller gene tageting. Så när man väl har sekvensen är man färdig då? Nej fäör man vet ju fortfarande inte vad dom flesta proteinerna har för funktion. Därför använder man genetiska metoder för att ta reda på det. LÄS!

Forward genetics eller genetisk screen * Mutagenisera med EMS, detta genererar punktmutationer=en bas byts ut * Titta i mikroskåp på dom muterade maskarnas barn * Plocka dom som uppvisar den sökta fenotypen * Genom att korsa med andra kända mutanter kan man leta sig fram i genomet och hitta den gen som blivit muterad. Tänkte kort gå igenom vad en gentisk screen är. LÄS! På så sätt kan man koppla DNA till en specifik funktion och få reda på vad genen har för funktion.

Gen-namnet beskriver mutantens fenotyp Exempel på gen-namn bli: blistered cuticle dpy: dumpy unc: uncoordinated eat: eating abnormal let: lethal rol: roller Sma:small Lon: long muv:multivulva Och så vidare…. I c.elegans finns massor med mutanter identifierad. Av tradition beskriver dom fenotypen på den muterade masken och förkortas till 3 bokstäver och 1 siffra.

Dumpy ~1 mm Tänkte bara visa hur några mutanter ser ut. Dumpy är engelska och betyder kort och tjock.

Roller ~1 mm Rollers mutanter kan inte gå i sinusvåg utan gör runda märken i plattan efter som den snurrar runt.

Unc (“Twitches”) ~1 mm Unc står för uncordinated och dessa har problem att ta sig fram.

Exempel på vad man hittat Alzheimer I dom flesta fall av ärftlig Alzheimers har man identifierat mutationer i en gen som heter presenilin-1. Finns en homolog i C.elegans=sel-12 Om denna gen inte kan fungera i masken får masken en muv(multivulva) fenotyp! Jag tänkte ge ett litet exempel på hur man kan använda masken för att studera saker som påverkar oss. Alzheimer är ju inget man direkt tänker sig att man kan studera i en mask, dessa får ju knappast denna sjukdom. Men man har identifierat en gen som ofta är muterad i ärftlig Alzheimer, presinilin-1. Det finns en homolog, liknande, gen i C.elegan sel-1. sel-1 mutanter får en fenotyp som kallas multivulva. Dvs den bildar flera stycken vulvor. Hur går det till?

Sel-12/presenilin är en del av en komplicerad och konserverad signal kedja som om den förändras leder till olika fenotyper beroende på organism. I människa leder presilin mutationer till att det bildas mer av en typ av peptider som bilda långa fibrer och skapa sk plack. Hos c.elegans leder mutationer i sel12 till att en viss celltyp aktiveras vulva gener i celler som egentligen inte skall bli vulva och därför får man flera vulvor.

I masken ger mutation upphov till en lätt identifierad fenotyp Användning I masken ger mutation upphov till en lätt identifierad fenotyp som kan identifieras i en genetisk screen. Det handlar INTE om att studera själva syndromet Alzheimer utan hur det uppkommer. Låta masken äta droger för att studera hur den påverkas För att identifiera fler proteiner involverade och för att förstå mer om signalkedjan kan man lätt göra genetiska screener eftersom fenotypen är lätt identifierad. Man kan ju också testa hur potentiella droger påverkar denna signalväg i maksen.

Vad gör jag? Använder genetiska screener för att hitta proteiner involverade i fettmetabolism. Vi färgar med ett rött färgämnen, Nile Red, och muterar maskarna och letar efter förändringar. Ett projekt som vi precis startat och hoppas kunna hitta intressanta saker.

Använder reverse genetics för att studera en gen familj, Forkhead(fkh), involverad i utvecklingen hos C.elegans, mus och människa. Använder bla maskar som har vissa specifika celler (tex muskler) markerade med GFP (Green Fluorescent Protein). Hur ser en mask med “vår” gen muterad ut? Vi har hittat att när fkh proteinet inte finns så har flera celler problem att ta sig till rätt plats i masken och att differentiera,dvs få sin specifika identitet tex bli en muskelcell. Vio tittar på en gen familj som heter forkhead. Detta är proteiner som påverkar andra proteiner genom att slå av och på dom. I c.elegans finns flera stammar som har ett protein märkt med GFP och detta uttrycks sedan i specifika celler. Vi slår ut vår gen med rreverse genetics och ser vad som händer. Det vi framförallt identifierat är att i många fall har cellerna svårt att hitta sin plats i masken och att dom inte kan differentiera eller mogna på rätt sätt.