Presentation laddar. Vänta.

Presentation laddar. Vänta.

Polymerase Chain Reaction Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell

Liknande presentationer


En presentation över ämnet: "Polymerase Chain Reaction Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell"— Presentationens avskrift:

1 Polymerase Chain Reaction Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell

2 Polymerase Chain Reaction Kary Mullis f.1944 Presenterade PCR i Science 1985 Nobelpriset i kemi 1993

3 Vad är PCR? Kopieringsmaskin för DNA? Kan påvisa att ett prov innehåller en viss gen

4 Varför var PCR revolutionerande? Kan kopiera EN SPECIFIK DNA- sekvens bland tusen andra gener Snabb (jämfört med genkloning) Känslig kan detektera DNA från enstaka celler Robust kan detektera DNA från fossila prover

5 Repetition: syntes av ny sträng Templat: ssDNA som fungerar som mall för den nya strängen Primer: för att starta DNA- syntesen Nukleotider(dNTP´s): utgör ”byggstenar” i DNA DNA-polymeras: enzym som bildar fosfodiesterbindning mellan 5´P och 3´OH

6 Vad behöver man i röret? Templat (prov med DNA) Forward primer (startsekvens) Reverse primer (startsekvens) dNTP´s (byggstenar) Taq DNA polymeras Buffert, salter Nukleotider Primers Polymeras Buffer Salt DNA

7 Vad händer i röret? Tre steg: Denaturering 95 o C Annealing av primers o C Syntes av ny str ä ng 72 o C Detta upprepas ggr

8 Två primers behövs Taq Taq Riktning på extension 3’ reverse Primer 5’ forward Primer DNA templat Forward primer –Hybridiserar uppströms om genen Reverse primer –Hybridiserar nedströms om genen Syntes ”in mot genen” 5’ 3’ 5’

9 Taq DNA polymeras Värmestabilt Optimalt vid 72 °C Adderar nukleotider komplementära till templatsträngen Dubbelsträngad DNA bildas Syntes från 5´till 3´

10 Amplifiering av målsekvens! ml

11 Resultat Området mellan primrarna; målområdet, ”target” amplifieras exponentiellt x2 x2 x2 x2 osv…. Efter 30 cykler har man fått ca 1 x 10 9 kopior av målområdet

12 Detektion av PCR-produkt Gelelektrofores –Separation av DNA Färgning av DNA Alt: Realtids- PCR

13 Vad betyder ett band i gelen Det har bildats DNA- molekyler vid PCR- reaktionen. Primrarna måste ha bundit till DNA i provet Det finns sekvenser som är komplementära till primrarna Slutsats: Vi har påvisat att vårt mål-DNA fanns i provet

14 Tillämpningar Diagnos av bakt/virusinfektion Rättskemiska analyser Diagnos av ärftliga sjukdomar Sekvensering Kloning Kvantifiering av genuttryck (RT-PCR) Med mera!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

15 Begränsningar? Man måste känna till sekvensen på båda sidor om den DNA-sekvens man vill amplifiera Kan ej amplifiera långa gener

16 Problem vid PCR Ospecifika produkter Kontamination Inhibition

17 Optimering av PCR-reaktion Val av primerpar Annealingtemperaturen (beror på primers) Mg 2+ -koncentration

18 Ospecifika produkter Vad har hänt? Hur kan det bildas flera produkter?

19 Primerlängd 8-mer ger statistiskt möjliga sekvenser att hybridisera till i humana genomet 17-mer har 1 chans på bp att slumpmässigt hitta en komplementär sekvens Fig Brown Gene Cloning

20 Kontamination ”Carry-over” kontamination från ett amplifierat positivt prov till ett nytt prov En aerosoldroppe kan innehålla 500 kopior av målområdet Efter amplifiering har man fått miljoner kopior; falskt positivt prov För att upptäcka ev. kontaminering körs en negativ kontroll (utan templat DNA) Positivt prov Negativt prov kontamination

21 Separata rum DNA extraktion prePCR rum (renrum) PCR rum

22 Inhibering Rester från prov eller DNA-extraktion kan inhibera PCR-reaktionen Risk för falskt negativa prov Intern kontroll tillsätts, om den inte amplifieras tyder det på inhibering PCR-film

23 Brister med traditionell PCR Separata steg för amplifiering och detektion; risk för kontaminering Långsam, svår att automatisera Mäter vid slutpunkt; osäker kvantif. Svårt att jämföra effektivitet vid olika PCR-reaktioner

24 Realtids-PCR Mha fluorescerande molekyler kan man detektera PCR-produkter varje cykel Mätning av PCR-produkter under den exponentiella fasen ger ett säkrare värde än mätning efter att alla cykler körts (end point)

25 End point/Real time Konventionell PCR –Analyserar produkten vid slutpunkt Realtidsmätning –Bildad produkt detekteras med fluorimeter –Mäter PCR-produkt vid varje cykel lc_principles/lc_principles_ind.htm

26 C T = Cykel vid tröskelvärde Exponentiell fas. Varje cykel: 2x DNA Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden C T =den cykel när signalen passerar ”tröskeln” Ju mer mål-DNA desto lägre C T (BioRad)

27 Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering 96 replikat av identisk reaktion Slutlig mängd varierar Tröskelvärde (C T ) varierar inte (Fig från BioRad) VARFÖR?

28 Realtids-PCR iCycler BioRad, mikrotiterplattor LightCycler Roche, kapillärer ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor

29 Realtids-PCR Fördelar –Lättare att undvika kontamination Behöver ej öppna röret för detektion –Säkrare kvantifiering av mål-DNA

30 Realtids-PCR Tillämpningar –Kvantitativ analys (Q-PCR) Ex. jmf mRNA i olika celler –Multiplex PCR (flera primerpar ger flera olika PCR-produkter) Ex. detektera flera virustyper i samma prov –Detektion av mutationer (med FRETprober och smältkurvsanalys)

31 Spel chemistry/pcr/index.htmlhttp://nobelprize.org/educational_games/ chemistry/pcr/index.html

32 Länkar Gör en virtuell PCR: Gå in på nedanstående länk, Välj The Bacterial Identification Lab, Öppna dörren till labbet och kör en PCR!


Ladda ner ppt "Polymerase Chain Reaction Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell"

Liknande presentationer


Google-annonser