Presentation laddar. Vänta.

Presentation laddar. Vänta.

Oscar Díaz Molekylära metoder för kartläggning av genetisk diversitet - en översikt Oscar Diaz.

Liknande presentationer


En presentation över ämnet: "Oscar Díaz Molekylära metoder för kartläggning av genetisk diversitet - en översikt Oscar Diaz."— Presentationens avskrift:

1 Oscar Díaz Molekylära metoder för kartläggning av genetisk diversitet - en översikt Oscar Diaz

2 Oscar Díaz Biodiversitet 2. Artnivå 3. Ekosystemnivå 1. Populationsnivå (genetisk diversitet) - Inom populationer (allelkombinationer hos olika individer) - Mellan populationer (skillnader i frekvens av olika alleler) Oscar Diaz, NGB

3 Oscar Díaz Kartläggning av genetisk variation Area 1 Population 1 Region 1Region 2Region 3 Population j Population k Population u Population t Population i Population s Individual Population 2 Population 3 Mängden och fördelning av genetisk variation kan uppskattas på olika sätt beroende på vilken organisationsnivå man befinner sig på Oscar Diaz, NGB

4 Oscar Díaz Kartläggning av genetisk variation Fenotypiska egenskaper (genotyp + miljö) Genotypiska egenskaper (genetiska delen hos en individ) Oscar Diaz, NGB

5 Oscar Díaz Vilka metoder används för att kartlägga den genetiska variationens mängd och fördelning hos en art? 1.Morfologiska metoder 2.Molekylära metoder

6 Oscar Díaz Fördelar  Kostnadssnåla  Snabbare att studera i jämförelse med molekylära markörer Nackdelar  Oftast miljöpåverkade  Karaktärerna är inte slumpmässigt valda  Svårt att studera skillnader på allel-nivå  Beroende av plantans utveckling Fenotypiska egenskaper Fenotypiska egenskaper utgör ett relativmått som inte kan nyttjas för att beräkna den absoluta genetiska likheten mellan olika material Oscar Diaz, NGB

7 Oscar Díaz Vilka metoder används för att kartlägga den genetiska variationens mängd och fördelning hos en art? 1.Morfologiska metoder 2.Molekylära metoder

8 Oscar Díaz Fördelar  Absoluta genetiska skillnader  Ej beroende av miljön  Potentiellt oändlig number av markörer  Mer säkert kvantifiering av genetisk variation DNA (molekylära) markörer Nackdelar  Dyr utrustning oftast behövs Oscar Diaz, NGB

9 Oscar Díaz Hög grad av polymorfism Reproducerbarhetkodominant Jämnt fördelad i genomet Att hitta skillnader mellan nära besläktade individer Ej beroende av varken miljö eller av plantans utveckling (hög heritabilitet) Neutral Enkel att använda Billiga Önskade egenskaper av DNA markörer Oscar Diaz, NGB

10 Oscar Díaz 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå 2. DIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

11 Oscar Díaz Elektroforetisk analys av isozymvariation DNA Protein Tissue extract Specific staining procedures Origin Stärkelsegelelektrofores (SGE) – Polyakrylamidgelelektrofores (PAGE)

12 Oscar Díaz 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå 2. DIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

13 Oscar Díaz RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Man klipper DNA från en individ med ett antal restriktionsenzymer De erhållna DNA-fragmenten separeras med elektrofores beroende på deras längd Metoden använder sig av “en probe” för att kunna upptäcka de olika banden “En probe” är en kort DNA- sekvens som oftast är märkt med ett radioaktivt ämne. När “proben” binder sig till motsvarande DNA-sekvens kan man identifiera de olika banden Probe DNA extraktion Restriktions- enzym Elektrofores Gel Membrane Proben binder sig till motsvarande DNA-sekvens RFLP

14 Oscar Díaz Hög grad av reproducerbarhet ko-dominanta markörer Enkel att genomföra om lämpliga prober finns tillgängliga Det krävs stora mängder DNA av hög kvalitet Tidskrävande och dyr Tidskrävande och dyr Radioaktivitet behövs Radioaktivitet behövs Ett stort antal artspecifika prober behövs för att hitta variation på populationsnivå Ett stort antal artspecifika prober behövs för att hitta variation på populationsnivå RFLP RFLP kan kombineras med användning av mikrosatelliter och minisatelliter (s k VNTR), men bandmönstren är oftast mycket svårttolkade

15 Oscar Díaz 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå 2. DIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

16 Oscar Díaz PCR (Polymerase Chain Reaction) Cyklisk kedjereaktion som upprepas många gånger för att bilda miljontals kopior av en bestämd DNA-sekvens + Nukleotider + Primer + Taq polymerase + Buffert lösning DNA Primer Polymerase

17 Oscar Díaz PCR-baserade tekniker, med “ospecifika primer” RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) DAF (DNA Amplification Fingerprinting) AP-PCR (Arbitrary Primed Polymerase Chain Reaction) MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) Genom Ospecifik primer

18 Oscar Díaz 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå 2. DIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

19 Oscar Díaz PCR-baserade tekniker, med “specifika primer” Mikrosatelliter - STMS (Sequence-tagged microsatellites) - SSRP (Simple Sequence Repeat Polymorphisms) - STR (Short Tandem Repeat) - SSR (Simple Sequence Repeat) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SRFA (Selective Restriction Fragment Amplification) AMO (Anchored Microsatellites Oligonucleotides) - ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) SCARs (Sequence-Characterised Amplified Regions) CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) Genom Specifik primer

20 Oscar Díaz 1.Om urvalet är för små, blir allelfrekverserna underskattade GenotypesAllele freq. Indivs. (no.) A 1 A 1 A 2 A 2 pq ,000,000300,000400,000300, Problem med dåligt urval Oscar Diaz, NGB

21 Oscar Díaz 2.Om några alleler räknas inte i urvalet: Initial population Frequency of A 1 (p) = 25/96 = Frequency of A 2 (q) = 68/96 = Frequency of A 3 (s) = 3/96 = Sample Frequency of A 1 (p) = 8/36 = Frequency of A 2 (q) = 28/36 = Frequency of A 3 (s) = 0/36 = (lost) n = 48 A1A2A1A2 A1A1A1A1 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A1A1A1 A1A1A1A1 A1A1A1A1 A1A1A1A1 A1A1A1A1 A1A1A1A1 A1A1A1A1 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A1A3A1A3 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A3A2A3 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A3A2A3 A2A2A2A2 A2A2A2A2 n = 18 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A2A1A2 A1A1A1A1 A1A1A1A1 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 A2A2A2A2 Problem med dåligt urval (forts.) Oscar Diaz, NGB

22 Oscar Díaz Tolkningen av olika bandmönster Isozymer(Aco) Mikrosatelliter (Primer ECGA22) RAPD (Primer C10) Aco-1 Aco-2 Aco-3 Aco-4 a b a b a b a a b c d e f g h i j k l C10-1 C10-2 C10-3 C10-4 Locus ECGA22

23 Oscar Díaz Statistisk bearbetning av resultaten BIOSYS-1 GENOTYPE FREQUENCY INPUT NOTU=2,NLOC=8,NALL=3 8(1X,A5)) ACO-1 ACO-2 ACO-3 ACO-4 MDH-2 PGD-1 PGD-2 PGM-1 STEP DATA: DATYP=2,NCOL=6,ALPHA; (6X,6(1X,2A1,1X,I2) Population 1 ACO-1 AA:50 ACO-2 BB:20 BC:30 ACO-3 AB:22 BB:28 ACO-4 BB:50 MDH-2 BB:49 BC:01 PGD-1 AA:50 PGD-2 AA:40 AB:10 PGM-1 BB:50 Population 2 ACO-1 AB:50 ACO-2 AB:20 BC:30 ACO-3 AB:22 BC:28 ACO-4 BB:50 MDH-2 BB:49 BC:01 PGD-1 AA:50 PGD-2 AA:40 AB:10 PGM-1 BB:50 BIOSYS-1 (Swofford & Selander 1989) (A computer program for the analysis of allelic variation in population genetics) Den absoluta mängden av genetisk variation - P = Frekvensen loci med genetisk variation - H = Heterozygoti Fördelningen av den totala genetiska variationen mellan och inom populationen Fördelningen av den totala genetiska variationen mellan och inom populationen Graden av genetisk likhet mellan populationer Graden av genetisk likhet mellan populationer - D = “Genetic distance”

24 Oscar Díaz Presentation av resultaten NTSYS (F. James Rohlf 1993) Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System PCA = Principal component analysis PCA-1 = 60.5% PCA-2 = 26.5% Russia Iceland Sweden Norway Dendrogram PCo-3(13.93%) PCo-1(28.08%) PCo-2(18.42%) PCoA = Principal coordinates analysis

25 Oscar Díaz Vad ska man tänka på när man väljer en metod för diversitetsstudier?  Hur många loci och alleler/locus behöver man undersöka?  Vilken organisationsnivå tänker man undersöka?  Har den tänkbara metoden en hög reproducerbarhet?  Har det någon betydelse om man väljer dominanta eller kodominanta markörer? Oscar Diaz, NGB

26 Oscar Díaz Vad ska man tänka på när man väljer en metod för diversitetsstudier?  Är DNA kvalitet en viktig förutsättning?  Finns kompetens tillgänglig?  Är laboratoriet utrustat mer de rätta verktygen?  Hur mycket pengar har man för undersökningen?  Hur mycket tid har man för att få fram resultaten? Oscar Diaz, NGB

27 Oscar Díaz EgenskaperIsozymRFLPRAPD Mikrosatelliter AFLP - OrganisationsnivåProteinDNADNADNADNA - Baserad påStärkelsegelHybridiseringPCRPCRPCR elektrofores - RestriktionsenzymNejJaNejNejJa - RadioaktivitetNejJa/NejNejNej/JaJa - InvesteringsbehovMycket LågHögLågHögHög - UtvecklingskostnadMycket LågHögLågMycket HögHög - Kostnad/reaktionLågMycket HögLågLågLåg - Prober/dag DataanalysLätt LättLättLätt Svårt - Kunskap/ErfarenhetLågHögMellanMycket HögMycket Hög - Del av genomet (%)Låg/MellanLåg/MellanMellanLågLåg - Locus-specifikJaJaJa/NejJaJa/Nej - PolymorfigradLågLåg/MellanHögMycket HögMycket Hög - ReproducerbarhetMycket HögMycket HögLågMycket HögHög - ÄrftlighetssättKodominantKodominantDominant KodominantDominant - Lämplig förPopulation-----PopulationPopulationPopulation ArtArt Art Mest använda molekylära metoder för diversitetsstudier IsozymRAPD AFLP SSRRFLP


Ladda ner ppt "Oscar Díaz Molekylära metoder för kartläggning av genetisk diversitet - en översikt Oscar Diaz."

Liknande presentationer


Google-annonser