Förändringar i genomet - mutationer och rekombination Molekylärbiologi, T3 Ht-11 Biomedicinska analytikerprogrammet Karolinska Institutet Annica Nordvall Bodell

Kunskapsmål för detta avsnitt Från kursplan: på ett övergripande sätt förklara de mekanismer som ligger bakom förändringar i genomet och dra slutsatser av vad detta kan få för konsekvenser för celler och individer

Lite mer utförligt: Olika typer av mutationer och hur de benämns Hur DNA-skador kan uppstå och hur dessa skador kan ge upphov till mutationer Vilka konsekvenser mutationer kan få för celler och individer Vilka reparationssystem som är viktiga för våra celler, samt principen för hur dessa fungerar Varför mutationer är vanligare i mitokondrie-DNA Terminologi (nonsense- missense- silent-mutationer, substitution, deletion, insertion/addition, transition/transversion, frameshift m.m.) Huvudtyperna av rekombination; homolog, platsspecifik och transposition Principerna för respektive rekombination. Exempel på var och när dessa typer av rekombination sker. Att rekombination kan användas inom gentekniken.

Vad är en mutation?

Olika typer av mutationer Små mutationer De flesta mutationer är små mutationer Punktmutationer – Transition/Transversion Frameshift mutationer – Insertion/deletion Strukturella kromosomförändringar Deletioner ( DE / ) Duplikationer Translokationer Inversioner Numeriska förändringar Aneuploidier Polyploidier

Olika typer av punktmutationer

Olika typer av punktmutationer forts.

Hur uppstår en mutation?

Ex på anledningar till spontana skador Replikationsmisstag Deaminering av baser Ex C U , Cmet T Depurinering/depyrimidering Ca 10 000 AP-sites / dag och human cell

Deaminering Spontana skador på DNA Depurinering

Ex på kemiska faktorer som kan inducera DNA-skada Interkalerande ämnen Ex EtBr – DNA sträcks ut, extra nt kan sättas in Ämnen som ändrar basers struktur och förmåga att baspara korrekt Ex alkylering, epoxider, DNA addukter

Interkalerande ämnen

Examples of DNA base Damage Induced by Chemicals Benzo-(a)pyrene

Strålning som kan orsaka DNA-skada Joniserande strålning (röntgen, gamma) Strängbrott, Crosslinking, Basförluster UV-strålning framförallt pyrimidindimerer (Tymindimerer)

Damage by UV-radiation

Reparationsmekanismer De flesta DNA-skador repareras innan de ger upphov till mutationer Om reparation ej skett innan skadat DNA replikeras kan mutation uppstå Reparationsmekanismer kan delas upp i Direct repair Excision repair Error prone repair Recombinational repair

Direct repair of ss break in DNA DNA ligase + ATP

Direct repair of O6-Methylguanine 6.20

Excision repair Base-Excision Repair (BER) 6.21

Nucleotide-Excision Repair (NER) Videolänk 6.22

Mismatch Repair

Error prone repair (E.coli)

Repair of double strand break

Recombinational repair

Varför rekombination? Rekombination innebär omlagring i genomet till skillnad från mutationer som introducerar ny information i genomet Viktigt för Variabilitet Reparation Immunförsvaret

Olika typer av rekombination Homolog/generell rekombination Platsspecifik rekombination Transposition

Homolog rekombination Kräver längre homologa sekvenser för rekombination Sker reciprokt – ömsesidigt utbyte Sker tex vid Meiosen (spermatogenes och oogenes) Recombination repair Omlagring av repetitiva sekvenser Mellan homologa bakteriekromosomer

Homolog rekombination under meiosen The Cell 16.34

Första steget i homolog rekombination enligt Holliday modellen Mest studerad i E.coli 1. Rec BCD särar på DNA strängen och introducerar nick The Cell 6.30

2. Rec A binder ssDNA och underlättar rekombination

Branch migration 3. Ruv A,B,C möjliggör ”branch migration” och klyver de överkorsade strängarna

Isomerisering och upplösning av Holliday modellen videolänk

Översikt homolog rekombination http://www.nature.com/nrm/journal/v2/n6/images/nrm0601_433a_i1.gif

Rekombinationen initieras förmodligen av ds brott i en av strängarna

Vad blir resultatet av homolog rekombination vid equal cross over? vid unequal crossover?

Unequal cross over

Platsspecifik rekombination Sker vid specifika sekvenser – ofta korta homologa sekvenser Medieras av proteiner som binder till de specifika sekvenserna Mest studerat är lambdas integrering i E.coil kromosomen Ex. i humana celler ; Ig-genernas rearrangering

Rearrangering av antikropps-gener

VDJ-rekombination The Cell 6.40

Transposition Förflyttning av transposoner (transposabla element) kräver ingen sekvenshomologi DNA transposoner förflyttar sig som DNA (vanligt i bakterier, har tidigare under evolutionen även skett i humana genomet) Retrotransposoner förflyttar sig via en RNA kopia (vanligt i högre eukaryoter)

Transposition av DNA-tranposon i bakterier

Modell för retrotransposition i eukaryoter

Hur kan rekombination utnyttjas inom gentekniken – några exempel Transgena djur Slumpmässigt införande av ny gen Utslagning av en specifik gen (”knock out”) Utbyte av en gen mot en annan (”knock in”) Genterapi?

Vad kan förändringar i genomet innebära för en gen? för en cell? för en individ?

Transgena möss – slumpmässig integrering av ny gen i kromosom

Specifik integrering (tex ”knock out möss”) kräver att man kan screena odlade ES-celler