Molekylära metoder för kartläggning av genetisk diversitet - en översikt Oscar Diaz

Biodiversitet 1. Populationsnivå 2. Artnivå 3. Ekosystemnivå - Inom populationer (allelkombinationer hos olika individer) 1. Populationsnivå (genetisk diversitet) - Mellan populationer (skillnader i frekvens av olika alleler) 2. Artnivå - Att bevara den biologiska mångfalden är det centrala målet inom naturvården i Sverige. Den biologiska mångfalden (= biodiversitet) bruka indelas i tre nivåer: ekosystemnivå, artnivå och genetisk nivå. - Forskning och utveckling i Sverige har intensifierats under senare år beträffande ekosystem- och artbevarande. Förhållandevis oerhört lite forskning har genomförts beträffande genetisk diversitet hos olika växtarter, speciellt när det gäller studier som är baserade på populationsgenetisk metodik. - För många vilda arter och flera odlade arter saknas elementär kunskap om deras genetiska struktur. Denna typ av kunskap är väsentligt om det genetiska värdet hos en art skall kunna avgöras och är en grundförutsättning för ett strategiskt och effektivt bevarandearbete (t.ex. beslut om reservatstorlek, geografisk fördelning av reservat, etc.). 3. Ekosystemnivå Oscar Diaz, NGB

Kartläggning av genetisk variation Area 1 Population 1 Region 1 Region 2 Region 3 Population j Population k Population u Population t Population i Population s Individual Population 2 Population 3 Mängden och fördelning av genetisk variation kan uppskattas på olika sätt beroende på vilken organisationsnivå man befinner sig på The distribution of polymorphism is observed for different hierarchical levels within the organization (areas, regions, populations, subpopulations, individuals) Oscar Diaz, NGB

Kartläggning av genetisk variation Fenotypiska egenskaper (genotyp + miljö) Genotypiska egenskaper (genetiska delen hos en individ) Oscar Diaz, NGB

Vilka metoder används för att kartlägga den genetiska variationens mängd och fördelning hos en art? Morfologiska metoder Molekylära metoder

Fenotypiska egenskaper Fördelar Kostnadssnåla Snabbare att studera i jämförelse med molekylära markörer Nackdelar Oftast miljöpåverkade Karaktärerna är inte slumpmässigt valda Svårt att studera skillnader på allel-nivå Beroende av plantans utveckling Fenotypiska egenskaper utgör ett relativmått som inte kan nyttjas för att beräkna den absoluta genetiska likheten mellan olika material Oscar Diaz, NGB

Vilka metoder används för att kartlägga den genetiska variationens mängd och fördelning hos en art? Morfologiska metoder Molekylära metoder

DNA (molekylära) markörer Fördelar Absoluta genetiska skillnader Ej beroende av miljön Potentiellt oändlig number av markörer Mer säkert kvantifiering av genetisk variation Nackdelar Dyr utrustning oftast behövs Oscar Diaz, NGB

Önskade egenskaper av DNA markörer Hög grad av polymorfism Reproducerbarhet kodominant Jämnt fördelad i genomet Att hitta skillnader mellan nära besläktade individer Ej beroende av varken miljö eller av plantans utveckling (hög heritabilitet) Neutral Enkel att använda Billiga Oscar Diaz, NGB

Molekylära metoder 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

Elektroforetisk analys av isozymvariation DNA Protein Tissue extract Specific staining procedures Origin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Stärkelsegelelektrofores (SGE) – Polyakrylamidgelelektrofores (PAGE)

Molekylära Kriterier 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Probe DNA extraktion Restriktions- enzym Elektrofores Gel Membrane Proben binder sig till motsvarande DNA-sekvens RFLP Man klipper DNA från en individ med ett antal restriktionsenzymer De erhållna DNA-fragmenten separeras med elektrofores beroende på deras längd Metoden använder sig av “en probe” för att kunna upptäcka de olika banden “En probe” är en kort DNA- sekvens som oftast är märkt med ett radioaktivt ämne. När “proben” binder sig till motsvarande DNA-sekvens kan man identifiera de olika banden

RFLP Hög grad av reproducerbarhet ko-dominanta markörer Enkel att genomföra om lämpliga prober finns tillgängliga Det krävs stora mängder DNA av hög kvalitet Tidskrävande och dyr Radioaktivitet behövs Ett stort antal artspecifika prober behövs för att hitta variation på populationsnivå RFLP kan kombineras med användning av mikrosatelliter och minisatelliter (s k VNTR), men bandmönstren är oftast mycket svårttolkade

Molekylära Kriterier 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

PCR (Polymerase Chain Reaction) Cyklisk kedjereaktion som upprepas många gånger för att bilda miljontals kopior av en bestämd DNA-sekvens + Nukleotider + Primer + Taq polymerase + Buffert lösning DNA Primer Polymerase

PCR-baserade tekniker, med “ospecifika primer” Genom Ospecifik primer RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) DAF (DNA Amplification Fingerprinting) AP-PCR (Arbitrary Primed Polymerase Chain Reaction) MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling)

Molekylära Kriterier 1. INDIREKT studerar skillnader på DNA-nivå - Icke PCR-baserade tekniker - PCR-baserade tekniker, “ospecifika primer” - PCR-baserade tekniker, “specifika primer”

PCR-baserade tekniker, med “specifika primer” Genom Specifik primer Mikrosatelliter - STMS (Sequence-tagged microsatellites) - SSRP (Simple Sequence Repeat Polymorphisms) - STR (Short Tandem Repeat) - SSR (Simple Sequence Repeat) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SRFA (Selective Restriction Fragment Amplification) AMO (Anchored Microsatellites Oligonucleotides) - ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) SCARs (Sequence-Characterised Amplified Regions) CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

Problem med dåligt urval Om urvalet är för små, blir allelfrekverserna underskattade Genotypes Allele freq. Indivs. (no.) A1 A1 A1 A2 A2 A2 p q 10 7 1 2 0.75 0.25 30 4 16 0.4 0.6 100 27 39 34 0.465 0.535 1000 299 395 306 0.4965 0.5035 1,000,000 300,000 400,000 0.5 (continued on next slide) The table above shows an example where, for just one gene (A) with two alleles, allele frequencies are calculated for samples of increasing numbers of individuals. When the sample size increases, the chance that all genotypes would be equally represented becomes higher. Hence, the estimate of allele frequencies becomes closer to the actual situation, and the conclusions of the experiment more reliable. Oscar Diaz, NGB

Problem med dåligt urval (forts.) Om några alleler räknas inte i urvalet: Initial population Frequency of A1 (p) = 25/96 = 0.260 Frequency of A2 (q) = 68/96 = 0.708 Frequency of A3 (s) = 3/96 = 0.031 Sample Frequency of A1 (p) = 8/36 = 0.222 Frequency of A2 (q) = 28/36 = 0.778 Frequency of A3 (s) = 0/36 = 0.000 (lost) n = 48 A1A2 A1A1 A2A2 A1A3 A2A3 n = 18 The example above shows a situation in which a subsample is taken from a population in such a way that allele A3, present in the original population, is omitted. The subsample does not contain all the alleles and is therefore not representative of the wider population. The description of the genetic diversity of the smaller sample, as an estimator of that of the bigger population, will not be equivalent or legitimate. Oscar Diaz, NGB

Tolkningen av olika bandmönster Isozymer (Aco) Aco-1 Aco-2 Aco-3 Aco-4 a b 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Locus ECGA22 Mikrosatelliter (Primer ECGA22) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 a b c d e f g h i j k l 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C10-1 C10-2 C10-3 C10-4 RAPD (Primer C10)

Statistisk bearbetning av resultaten BIOSYS-1 (Swofford & Selander 1989) (A computer program for the analysis of allelic variation in population genetics) Den absoluta mängden av genetisk variation - P = Frekvensen loci med genetisk variation - H = Heterozygoti Fördelningen av den totala genetiska variationen mellan och inom populationen Graden av genetisk likhet mellan populationer - D = “Genetic distance” BIOSYS-1 GENOTYPE FREQUENCY INPUT NOTU=2,NLOC=8,NALL=3 8(1X,A5)) ACO-1 ACO-2 ACO-3 ACO-4 MDH-2 PGD-1 PGD-2 PGM-1 STEP DATA: DATYP=2,NCOL=6,ALPHA; (6X,6(1X,2A1,1X,I2) Population 1 ACO-1 AA:50 ACO-2 BB:20 BC:30 ACO-3 AB:22 BB:28 ACO-4 BB:50 MDH-2 BB:49 BC:01 PGD-1 AA:50 PGD-2 AA:40 AB:10 PGM-1 BB:50 Population 2 ACO-1 AB:50 ACO-2 AB:20 BC:30 ACO-3 AB:22 BC:28

Presentation av resultaten NTSYS (F. James Rohlf 1993) Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Dendrogram PCA = Principal component analysis PCA-1 = 60.5% PCA-2 = 26.5% Russia Iceland Sweden Norway PCo-3(13.93%) PCo-1(28.08%) PCo-2(18.42%) PCoA = Principal coordinates analysis

Vad ska man tänka på när man väljer en metod för diversitetsstudier? Hur många loci och alleler/locus behöver man undersöka? Vilken organisationsnivå tänker man undersöka? Har den tänkbara metoden en hög reproducerbarhet? Har det någon betydelse om man väljer dominanta eller kodominanta markörer? Oscar Diaz, NGB

Vad ska man tänka på när man väljer en metod för diversitetsstudier? Är DNA kvalitet en viktig förutsättning? Finns kompetens tillgänglig? Är laboratoriet utrustat mer de rätta verktygen? Hur mycket pengar har man för undersökningen? Hur mycket tid har man för att få fram resultaten? Oscar Diaz, NGB

Mest använda molekylära metoder för diversitetsstudier Isozym RAPD AFLP SSR RFLP Egenskaper Isozym RFLP RAPD Mikrosatelliter AFLP - Organisationsnivå Protein DNA DNA DNA DNA - Baserad på Stärkelsegel Hybridisering PCR PCR PCR elektrofores - Restriktionsenzym Nej Ja Nej Nej Ja - Radioaktivitet Nej Ja/Nej Nej Nej/Ja Ja - Investeringsbehov Mycket Låg Hög Låg Hög Hög - Utvecklingskostnad Mycket Låg Hög Låg Mycket Hög Hög - Kostnad/reaktion Låg Mycket Hög Låg Låg Låg - Prober/dag +++ + ++ ++ ++ - Dataanalys Lätt Lätt Lätt Lätt Svårt - Kunskap/Erfarenhet Låg Hög Mellan Mycket Hög Mycket Hög - Del av genomet (%) Låg/Mellan Låg/Mellan Mellan Låg Låg - Locus-specifik Ja Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej - Polymorfigrad Låg Låg/Mellan Hög Mycket Hög Mycket Hög - Reproducerbarhet Mycket Hög Mycket Hög Låg Mycket Hög Hög - Ärftlighetssätt Kodominant Kodominant Dominant Kodominant Dominant - Lämplig för Population ----- Population Population Population Art Art ---- ---- Art