Polymerase Chain Reaction – PCR

En presentation över ämnet: "Polymerase Chain Reaction – PCR"— Presentationens avskrift:

1 Polymerase Chain Reaction – PCR
Dagens föreläsning: Repetition PCR - Primer design Analys av PCR qRT PCR Polymerase Chain Reaction – PCR Molecular cell biology 7th . Lodish et al. Kapitel 5

2 Användningsområden för PCR
Kopiering av kända DNA fragment från ex. genomiskt DNA Isolering av gensekvenser från organismer och jämföra dem Genterapi

3 Vad behövs för att sätta upp en PCR reaktion?
Templat Primers Nukleotider

4 Nukleotidens struktur

5

6 dATP vs. ATP

7 DNA Polymeras Buffert Värmekälla

8 Primerdesign Plats för att rita upp nukleotider och hur de binder till varandra.

9 Uppgift: Skriv sekvensen på PCR-primers; (hypotetiska 7 nt primers) som ska användas för att amplifiera ett 30 bp DNA fragment från ett dsDNA templat med nedan sekvens. Markera i sekvensen var dina förslag på primrar motsvarar. 5’ GAACCAACGATTACTAGGTAACACATAGATCTGCTACGCTAGCGTTGGACCCTAG 3’ 3’ CTTGGTTGCTAATGATCCATTGTGTATCTAGACGATGCGATCGCAACCTGGGATC 5’ dsDNA 5’ GAACCAACGATTACTAGGTAACACATAGATCTGCTACGCTAGCGTTGGACCCTAG 3’ 3’ CTTGGTTGCTAATGATCCATTGTGTATCTAGACGATGCGATCGCAACCTGGGATC 5’ Uppströmsprimer/5’ Nedströmsprimer/3’

10

11 PCR-reaktionens steg Hot start Denaturering Annealing Elongering

12

13 Cykler och amplifiering

14 Se figur 5-20 i Lodish

15 Analys av PCR Agaros EtBr/SYBR safe Stege/Markör Laddningsbuffert
Figur 5-19, Lodish

16 Agarosgel

17 1µg (10µl) av GeneRuler DNA Ladder Mix innehåller:
120ng av 500 bp fragmentet 120ng av 1000bp fragmentet 32ng av 2000bp fragmentet 120 ng av 3000bp fragmentet.

18 Spektrofotometri Lambert-Beers lag A=e x l x c

19 qRT PCR Vidareutveckling av PCR tekniken Mäta mRNA nivåer, genuttryck
Mäter PCR produkt efter varje cykel

20 qRT PCR Reverse transcriptase: SYBR green: House-keeping/referensgen:

21

22

23 Polymerase Chain Reaction – PCR
Dagens föreläsning: Repetition PCR - Primer design Analys av PCR qRT PCR Polymerase Chain Reaction – PCR Molecular cell biology 7th . Lodish et al. s