Telomeren - något att tänka på för hematologen? Magnus Hultdin Klinisk patologi Norrlands universitetssjukhus Umeå

Disclosures Konsultuppdrag/advisory board/betalda föreläsningar; Nej Forskningsstöd; 2

Telomerer – evolutionärt konserverad DNA-sekvens TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG 3

The end-replication problem 5’ 3’ Leading strand 3’ 5’ 5’ 3’ Lagging strand Kromosomände Förlust av DNA

Telomeras – bygger telomerer Armanios and Blackburn Nat Rev Genet 2012; 13, 693-704

Telomerkomplexet Calado and Young, N Engl J Med 2009;361:235. 6

”Gamla” fibroblaster - Senescence The Hayflick limit ”Gamla” fibroblaster - Senescence ”Unga” fibroblaster Fibroblaster från barn kan bara dela sig 50-60 gånger i cellodling Fibroblaster från vuxna/äldre färre celldelningar Senescence 7

Telomerlängden bestämmer “The Hayflick limit” ”Unga” fibroblaster ”Gamla” fibroblaster Senescence Population doublings 8

Modell för telomerlängdsförändring över tid Normala somatiska celler (telomeras -) Telomerlängd M1 Tid Senescence (The Hayflick limit) M1 = mortality stage 1

Modell för telomerlängdsförändring vid immortalisering p53 inactivation pRb inactivation Oncogene activation Telomerlängd M1 M2 Tid Senescence ”Crisis” M1 = mortality stage 1 M2 = mortality stage 2

Modell för telomerlängdsförändring vid immortalisering Immortaliserade celler (telomeras +) Telomerlängd M1 M2 Tid Senescence ”Crisis” M1 = mortality stage 1 M2 = mortality stage 2

Modell för telomerlängdsförändring in vivo Spermatocyter – telomeras ++ Stamceller, progenitorceller, lymfocyter - telomeras + Telomerlängd Somatiska celler - telomeras - Ålder

Telomerlängden i leukocyter minskar med ålder Nordfjäll et al. Eur J Hum Genet 2010; 18: 385-389 13

Telomerer och tumörutveckling Telomere shortening Genomic instability Apoptosis Tumor growth Telomerase activity

Telomerer och cancer Telomeras positivt >90% i cancer Telomererna är ofta korta i cancerceller Korta telomerer är kopplat till ökad risk för cancer

Ma et al. PlosOne 2011; 6(6): e20466

Telomerer och hematologiska maligniteter Telomeras positivt >99%. Telomererna är ofta korta Hög telomerasaktivitet och högt hTERT ofta mer aggressiv tumör Korta telomerer ofta sämre prognos

Telomerer och hematologiska maligniteter Svensson and Roos. Biochim Biophys Acta 2009; 1792. 317-323

Telomerlängd och KLL Mansouri et al. Am J Hematol 2013; 88: 647-651

The Hallmarks of Cancer Figure 6 The Hallmarks of Cancer Therapeutic Targeting of the Hallmarks of Cancer. Drugs that interfere with each of the acquired capabilities necessary for tumor growth and progression have been developed and are in clinical trials or in some cases approved for clinical use in treating certain forms of human cancer. Additionally, the investigational drugs are being developed to target each of the enabling characteristics and emerging hallmarks depicted in Figure 3, which also hold promise as cancer therapeutics. The drugs listed are but illustrative examples; there is a deep pipeline of candidate drugs with different molecular targets and modes of action in development for most of these hallmarks. Hanahan and Weinberg, Cell 2011, 144(5): 646-674 20

Telomerasinhibitorer Imetelstat Syntetisk nukleotidsekvens Interagerar med telomeraskomplexets templat Fas 2 studier Bröstcancer avbruten SCLC avslutad ET/PV pågår MF pågår

FISH (TTAGGG)4 probe 22

Telomerase gene mutation Cell replication Increasing age Oxidative stress Psychological stress Abnormal blood lipids Obesity Hypertension Smoking Telomerase gene mutation Telomerase Physical activity 24

Telomerase gene mutation Cell replication Increasing age Oxidative stress Psychological stress Abnormal blood lipids Obesity Hypertension Smoking Telomerase gene mutation Telomerase Physical activity 25

Modell för telomerlängdsförändring in vivo Spermatocyter – telomeras ++ 15 kb Telomerlängd Stamceller, progenitorceller, lymfocyter - telomeras + 5-7 kb 2-4 kb Ålder

Modell för telomerlängdsförändring in vivo vid telomerasmutationer 15 kb Spermatocyter – telomeras + Telomerlängd 5-7 kb Stamceller, progenitorceller, lymfocyter - telomeras -/+ 2-4 kb Dysfunktionella telomerer - sjukdom Ålder

Symptom vid telomerasmutationer “Telomersyndrom” Knock möss grunden Armanios JCI 2013; 123, 996-1002

Mutationer i telomeraskomplexet Armanios and Blackburn Nat Rev Genet 2012; 13, 693-704

Mutationer i telomeraskomplexet >90 % av mutationerna har påvisats i: - TERT - TERC Heteozygota mutationer Autosomalt dominanta med haploinsufficiens (”Halverad telomerasaktivitet”)

Mutationer i telomeraskomplexet Ovanliga mutationer Armanios and Blackburn Nat Rev Genet 2012; 13, 693-704

Korta telomerer vid dyskeratosis congenita (DC) Telomerase gene mutation Figure 10.32a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) 32

Dyskeratosis congenita Mucocutana symptom Hyperpigmenterad hud Oral leukoplaki Nageldystrofi Benmärgssvikt Calado and Young. N Engl J Med 2009; 361: 2353-2365

Vuxna med telomersyndrom Idiopatisk lungfibros Benmärgssvikt Aplastisk anemi MDS/AML Cryptogen levercirros Ökad risk maligniteter Svarar inte på immunsupprimerande behandling

Vuxna med telomersyndrom – multifaktoriellt? Calado and Young. N Engl J Med 2009; 361: 2353-2365 35

Armanios JCI 2013; 123, 996-1002

Telomerer och tumörutveckling Telomere shortening Genomic instability Apoptosis Tumor growth Telomerase activity

Telomerer och tumörutveckling – muterat telomeras Telomere shortening Genomic instability Apoptosis Tumor growth + Telomerase activity

Telomerlängden går i arv Nordfjäll et al. Eur J Hum Genet 2010; 18: 385-389 39

Telomerlängd ärftligt - anticipation Armanios. Mut Res 2012; 730: 52-58 40

Anticipation Armanios and Blackburn Nat Rev Genet 2012; 13, 693-704

Kan ärvda korta telomerer bli långa? Armanios and Blackburn Nat Rev Genet 2012; 13, 693-704

Korta telomerer vid sjukdom DKC1-mutation TERC-mutation TERT-mutation TINF2-mutation Vulliamy et al. PLoSONE 2011; 6, e24383

Telomerlängden avgör inte klinisk bild DKC1-mutation TERC-mutation TERT-mutation TINF2-mutation Vulliamy et al. PLoSONE 2011; 6, e24383

Familjehistorik starkt kopplat till telomerasmutationer 38 konsekutiva patienter som inkommit på remiss till Johns Hopkins Hospital, Baltimore pga aplastisk anemi eller idiopatisk lungfibros. Inklusion om familjeanamnes eller egna sekundära sjukdomar Parry et al. Blood 2011; 117, 5607-5611

Familjehistorik starkt kopplat till telomerasmutationer Parry et al. Blood 2011; 117, 5607-5611

Något att tänka på för hematologen? Vid utredning av Aplastisk anemi Benmärgssvikt MDS AML Finns lungsjukdom, leversjukdom och blodsjukdom i släkten? Har patienten lung- eller leversjukdom? Tecken på tidigt åldrande?

Telomersyndrom – behandling? - Allogen stamcellstransplantation - Patienter känsliga för DNA-skadande ämnen - Myeloabladive behandling dålig prognos - Non-myeloabladive behandling möjligen bättre prognos - Androgenbehandling? - Östrogen?

Genetisk analys vid telomerasmutation? Diagnostiskt värde – kan styra val av behandling och uppföljning Patienter med mutation har dålig effekt av immunsupprimerande behandling och är känsliga för DNA-skadande behandling Möjliggör uppföljning av patient och släktingar som är bärare av mutationen Möjliggör att exkludera släktingar som potentiella donatorer

Genetisk analys - telomerasmutationer Klinisk genetik, Laboratorimedicin, Umeå Uppsatt 2 år 32 patienter undersökta 3 mutationer https://webappl.vll.se/provtagningsanvisningar

Genetisk analys steg 1 TERT (5p15): 16 exons telomerase reverse transcriptase TERC (3q26): 1 exon telomerase RNA component TERT is the catalytic component. TERC provides the template for nucleotide addition by TERT. 51

Genetisk analys steg 2 DKC1 (Xq28): 15 exons TINF2 (14q12): exon 6 dyskerin (telomerase complex) TINF2 (14q12): exon 6 TRF1-interacting nuclear factor 2 (shelterin complex) The shelterin complex is a group of proteins that interact to protect the telomeres. 52

Sekvensering DNA prep from peripheral blood (5-10 ml EDTA) Sequencing on ABI 3500xL Dx 53

Mutationsdatabas http://telomerase.asu.edu/

Vid fynd av mutation Kliniskt heterogen sjukdom Reducerad penetrans Anticipation Allvarligare symptom i senare generationer Finns polymorfier (TERC) De novo mutationer (DKC1)

Familj med TERT-mutation TERT c.2147C>T, p.A716V Bioinformatic evidence: highly conserved, important protein domain (telomere reverse transcriptase). AGVGD=0. PolyPhen=damaging 1.000. SIFT= not tolerated. Small amino acid change (GV=64, hydrofob  hydrofob). No splice effect. Published evidence: Known mutation (Du et al. 2009; severe pancytopenia and aplastic anemia) dbSNP: Not known 56

Telomerlängdsanalys av familj med TERT-mutation Age 120 100 80 60 40 20 Relative Telomere Length (RTL) 3,44 2.58 1.72 0.86 0.00 1.29 0.43 6372 8003 7419 7850 8401 Brother no mutation Proband TERT mutation

Familj med TERC-mutation The proband is a 30-year old man with aplastic anemia. He has had very low thrombocytes since childhood, and received a bone marrow transplantation 2012. He died in 2013. The parents are healthy, but there is an accumulation of affected cases on the father´s side. Mutation analysis in the proband identified a sequence variant in TERC, which is also present in his father and his son. TERC n.377A>G + Bone marrow failure 30y 58

Telomerlängdsanalys av familj med TERC-mutation Age 120 100 80 60 40 20 Relative Telomere Length (RTL) 3,44 2.58 1.72 0.86 0.00 Father =variant Son =variant Siblings =no variant Proband =TERC variant

Telomerer i Umeå Göran Roos Pia Osterman Christer Mehle Karl-Fredrik Norrback Magnus Hultdin Katarina Nordfjäll Pawel Grabowski Sofie Degerman Ulrika Svensson Magnus Borssén Eleonor Lindström Eriksson Ulla-Britt Westman Elisabeth Grönlund Raviprakash T Sitaram Linda Köhn Susann Haraldsson Helene Sandström Mattias Landfors Anna Norberg

https://webappl.vll.se/provtagningsanvisningar goran.roos@medbio.umu.se anna.norberg@vll.se magnus.hultdin@vll.se https://webappl.vll.se/provtagningsanvisningar