K-RAS Mutationsanalys Molekylärpatologi Gastrointestinala sjukdomar 30 November 2010 Jenny Thureson Leg Biomedicinsk analytiker

Medicinsk diagnostik Laboratoriemedicin Klinisk radiologi Klinisk fysiologi Klinisk patologi Klinisk kemi Mikrobiologi Förvaltningen bildades 1 jan 2010 600 medarbetare De här 3 som arbetar med molekylära analyser Patologen: 2 st Kemi: 3 st Mikro: 15-20 st Vi gör Bcr-abl och K-RAS. Har gjort K-RAS i drygt 1 år. Analyserna har satts upp på klinikernas begäran. Det skiljer sig vilka lab som utför vilka analyser över landet. Vissa har genetikavd som utför analyserna. I Örebro ex är det molekylärpatologi som kör JAK-2

Sättrum Upp- arbetningsrum Mastermix- rum FoU-lab Sättrum Cell- odling Pre-PCR DNA Post-PCR Sättrum Upp- arbetningsrum Mastermix- rum FoU-lab Sättrum Cell- odling Kyl/ Frys Frys Kyl Schematisk bild hur molekylärlabbet är uppbyggt på plan 4. Viktigt hur man jobbar. Rosa renast – gul smutsigast med amplifierat material. Upp- arbetningsrum Instrumentrum Förråd RNA

Bakgrund

Bakgrund

Analys Provpreparering Extrahering av DNA (2 steg) Realtids-PCR Databearbetning/Resultat Kvalitativ bedömning av mutationsstatusen Vi gör analysen här i Jönköping eftersom klinikerna efterfrågade den Används för att mäta mängden av en DNA-sekvens i provet med hjälp av fluorescenta prober eller fluorescent infärgning. En särskild maskin för reglering av temperatur och avläsning av fluorescens behövs, vanligen i kombination med en dator.

Provpreparering Beställning Patolog märker ut tumörområde på kloss Klossen snittas Snitten läggs i eppendorfrör (3 x 10 µm) Beställning från onkologen med förslag på vilket PAD man vill ha analyserat. Det kan vara så att vi inte tycker att materialet är lämpligt Jobbar rent. Ny kniv, tvätt med DNAaway, tvätt av pincett mellan varje prov som snittas

Extrahering av DNA Avparaffinering över natt Extrahering DNA Kolonnbaserad metod Paraffin löses upp i xylen och tas bort. Lysering: (lysera= gå sönder) Provet lyseras under nedbrytande förhållanden mha enzymet Proteinase K. Värmebehandling: Inkubation i 90 grader för att ta bort korsbindningar av formalin (ta bort det sista av formalinet) Fortsätter extrahering plan 4. Tillsätter provet till en kolonn. I kolonnen finns ett membran som DNA binder till. Tvätt: Återstående av kontamineringar tvättas bort. Eluering: ren, koncentrerad DNA elueras/utvinns från membranet.

Koncentrationsbestämning DNA Nanodrop (ng/µL) Mäter koncentrationen på DNA mha absorbans

Realtids-PCR Beräkning av patient DNA koncentration till LightCycler 480 Real-Time PCR prov nr 63 65 66 67   vatten (µL) 45,9 44,7 28,9 47,2 - Volym pat DNA (µL) 4,1 5,3 21,1 2,8 tot volym (µL) 50 DNA till PCR (ng /µL) 8 Patient DNA konc (ng/ µL) 98 76 19 141 Lägger in värdet i exelfil för att se hur vi ska späda det koncentrerade DNA:t för att få rätt mängd in i PCR-reaktionen.

Tot volym Reaktionsmix Realtids-PCR Mastermixberedning Antal prov: (x + 2 *1,1) (x = antal patientprover + Mixad Standard + NTC) 6 Analys Huvudmixar Reaktionsmix (µL)x1 Taq (µL)x1 Tot volym Reaktionsmix Tot volym Taq K-RAS 19,8 0,2 130,7 1,32 Dags att göra mastermix. Kitet består av 7 mutationer, 1 pos kontroll, 1 intern kontroll, Taq polymerase (enzym)

Realtids-PCR Sättningsrum Sättningsschema Mastermix + kontroll + prov + NTC Sättning platta Optisk film Centrifugering Analys 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Kontroll Mix standard NTC B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Speciellt sättningsrum. UV-bänk. Efter dagens slut sätter man igång UV-ljuset och det förstör DNA:t. Följer ett speciellt sättningsschema på plattan. Tillsätter mastermix, pos kontroll, prov och NTC (neg kontroll som alltid sätts först på plattan) Försluter plattan med optisk film (genomskinlig plast). Centrifugerar ner så att all lösning hamnar i botten av brunnen.

Realtids-PCR LightCycler 480 Ca 1 h 50 min Sätter in plattan i instrumentet och väljer önskat program i datorn.

Databearbetning/Resultat Efter 1h 50 min ser det ut ungefär så här. Uppgången på kurvorna visar att det finns mutationer.

Databearbetning/Resultat Ex Gly12Asp Mjukvara 12 Asp (GGT>GAT) 12 Ala (GGT>GCT) 12 Arg (GGT>CGT) 12 Cys (GGT>TGT) 12 Ser (GGT>AGT) 12 Val (GGT>GTT) 13 Asp (GGC>GAC) De 7 mutationerna är egentligen följande aminosyror som har ändrat sig. Till vår hjälp har vi en mjukvara som hjälper oss att räkna ut vilka mutationer som finns. Underlättar mycket då det sker en hel del korsreaktioner i just denna analys.

Databearbetning/Resultat Mha av mjukvaran får vi fram en PDF-fil som visar precis om körningen är godkänd, alla kontroller är ok och vilka mutationer som ev finns. Svarar sedan ut resultatet i vårt eget labdatasystem SafirLis.

Tack för mig! Så här ser en mer detaljerad bild ut över EGFR-signalering. Så om man är intresserad kan man lägga ner många timmar på just denna del