Detektion och kvantifiering av HTLV-1 och -2 med Droplet Digital PCR Lorraine Eriksson, Biomedicinsk analytiker, Doktorand Laboratoriemedicinska Kliniken, Molekylärdiagnostik F&U Universitetssjukhuset Örebro

Humant T–lymphotroft virus (HTLV) Humant retrovirus Lymfocyter RNA -> proviral DNA Smittar via infekterade celler Blodprodukter, orena kanyler, sexuell kontakt och från mor till barn genom amning. HTLV-1 och HTLV-2 Asymtomatisk –bärare HTLV-1: adult T-cells leukemi/lymfom (5 %), HTLV-1 associerad myelopati/tropisk spastisk pares (2-3 %) HTLV-2

HTLV infektioner HTLV-1 Japan, Afrika, Karibien, Syd Amerika och Iran HTLV-2 ursprungsbefolkning i Syd och Nord Amerika och bland injicerande missbrukare

HTLV diagnostik Nya Blod- & plasma givare screenas. Par som utreds för assisterad befruktning. Klinisk misstanke om HTLV-infektion Specifika antikroppar mot virus. Konfirmation med ytterligare antikroppstest eller vid behov PCR. Pro viral load (PVL) – % av lymfocyter innehåller DNA-kopior av HTLV Hög PVL – högre risk att utveckla sjukdom

HTLV diagnostik forts. Laboratoriemedicinska kliniken, USÖ är referenslab för HTLV Ingen PCR-metod för bedömning av pro-viral load har fram till nu funnits i Sverige. Proverna har skickats till London (Imperial College, St Mary’s Hospital) för bedömning av pro-viral load.

Droplet digital PCR (ddPCR) Absolut kvantifiering av DNA- och RNA-molekyler utan att behöva använda standardkurvor

Material Buffy coat – lymfocyter Cellräkning i helblod; Sysmex, Klinisk kemi

Droplet generering Mix: Supermix, Primer & probe, DNA Olja Tryck över prov och olje brunnarna Provet samt oljan trycks genom rör i cartridge Upp till droppar skapas – täckta i olja

PCR-amplifiering HTLV-1 & RPP30 HTLV-2 & RPP30 PCR reaktion kommer ske i varje droppe som innehåller minst en kopia av target Detektion vid end-point

Droplet reader Individuell analys fluorescense; FAM och VIC(HEX) form & storlek på droppar Positiva eller negativa droppar – fluorescence signal. Har skett en PCR reaktion

Quantasoft analysera resultat Konc. som kopior/µl - positiva droppar & Poisson algorithm Minst droppar

Pro-viral load

Variation och känslighet Intra-assay variabilitet HTLV-1: CV = 0,97-3,34 % HTLV-2: CV = 1,71-8,2 % Inter-assay variabilitet HTLV-1: CV = 1,84-6,13 % HTLV-2: CV = 1,18-12,89 % PROBIT HTLV c/mL 100 % 444 c/mL 40 % HTLV c/ml 100 % 444 c/mL 20 %

Korrelation ddPCR - qPCR

Resultat Inno-LIAqPCRddPCR Totalt antal prover PositivNegativPositivNegativ HTLV-1 positiv HTLV-2 positiv Indeterminant Negativ 01011

Resultat Falsk positivitet och svagt positiva prover ≤ 3 droppar kunde i vissa fall detekteras i NTC under optimering och utvärdering av ddPCR-metoden. Samtliga kliniska prover sätts x 4 ospädda och x 1 spädda 1/10. Svagt positiva prover (1-3 droppar/brunn) bedöms positiva om positiva droppar finns i alla brunnar.

Mutationer Mutation C  A alt. C  T Ingen mutation

Konklusioner ddPCR möjliggör pålitlig och känslig bestämning av PVL för både HTLV-1 och HTLV-2. Korrelationen mellan PVL analyserade med qPCR och PVL analyserade med ddPCR är mycket bra. Den låga intra- och inter-assay variabiliteten gör ddPCR till en lämplig metod för HTLV-diagnostik och för att följa patienter över tid. Sedan 1 juni 2015 kvantifieras och bestäms HTLV PVL med ddPCR på Laboratoriemedicinska Kliniken, Molekylärdiagnostik FoU. 62 prover på ddPCR.

TACK!