Microbiology in activated sludge processes Sara Hallin SLU © Sara Hallin

Wastewater treatment Historically…. Sanitation problems 1850-1930 Environmental problems 1930-2000 Recycling 2000- Biological treatment was introduced in the 1950’s. The activated sludge processes dominates and is the largest biotechnology industry in the world. 500 l sewage per person and day in Sweden! (1,6 x 109 m3/yr)

activated sludge processes Microorganisms in activated sludge processes Microorganisms are the activated sludge process! Bacteria, fungi, viruses, protozoa, algea and metazoa… Microorganisms enter the treatment plant from the sewage system.

Activated sludge processes Aeration basin and settling tank. The concept: Microorganisms (biomass) grow in the aeration tank and degrade organic matter while consuming oxygen. Floc formation is essential for settling. The retention time for microorganisms exceed that for the sewage. Nitrogen removal: Biological Phosphorus removal: Chemically or biologically.

Life on earth

All organisms Chemical energy Light energy Chemotrophs Phototrophs Litotrophs Organotrophs Heterotrophs Autotrophs Autotrophs Mixotrophs

Metabolism

Aerobic respiration

- V V V Aerob Respiration (organotrof) Fermentation (organotrof) NADH Redox Aerob Respiration (organotrof) Fermentation (organotrof) - Glukos Glukos 2 ATP 2 ATP Glukolys Glukolys 2 NADH 2 NADH 2 Pyruvat 2 Pyruvat Fermentationsreaktioner V V 8 NADH Citronsyra cykeln 2 GTP 6 CO2 2 FADH V Pyruvat NADH ATP FADH NADH AcCoA Acetaldehyd ATP NAD+ NADH ATP ATP NAD+ Laktat Etanol Acetate O2 H20 +

Biochemical events in activated sludge Catabolism Organics (C, H, O, N, P, S) + Oxygen Biomass CO2+H2O+SO42- PO43-+NO3- Mineralised products Energy (ATP) Reducing Power Precursors Anabolism Biomass Waste

Traditionell ASP Organiskt material bryts ner av mikroorganismer i luftningsbassängen. Slammet (biomassa och organiskt material)avskiljs från det renade vattnet i sedimenteringsbassängen. .

Microbiological reactions in the N cycle NH4+ NO2- NO3- N2O NO NO2- Organically bound nitrogen org-NH2 N2 Nitrogen fixation Nitrification Assimilation Mineralization/ Ammonification ATMOSPHERE SOIL/WATER Denitrification Dissimilatory nitrate reduction to ammonium

Nitrification in water treatment Nitrification lowers BOD load in recipient Nitrification coupled to denitrification lowers N load in recipient Nitrogen removal systems: - natural wetlands - constructed wetlands - wastewater treatment plants Process problems with inhibition: Microbial sensors for detecting nitrification inhibitors

Nitrification Nitrification involves several reactions and two different bacteria: 1. Dissociation of ammonium 2. Oxidation of ammonia Ammonia monooxygenase (AMO): Integral membrane protein Can oxidize methane Cometabolize halogenated compounds Inhibited by acetylene 3. Oxidation of hydroxylamine Hydroxylamine oxidoreductase (HAO): Soluble, periplasmic protein 4. Oxidation of nitrite Nitrosomonas

Ammonia oxidation: NH3 + 1,5O2 NO2- + H+ + H2O

Nitrite oxidation: NO2- + ½ O2 NO3- Periplams OH-

Carbon metabolism Cell constituents Growth

Energetic constraints... Energetic constraints are severe, particularly for NO2- oxidizers. Many NO2- also grow chemoorganotrophically on glucose or other substrates. 1. ATP and NADPH (reducing power) requirements in Calvin cycle 2. NAD(P)H formed by reverse e- flow: Cyt c 2e- O2 NAD(P)+ e-

The nitrifying bacteria Key genera: Nitrosomonas, Nitrobacter Phylogenetically  or  Proteobacteria (except Nitrospira) Nitrosomonas europeae NH3 oxidizers Nitrosomonas Nitrosococcus Nitrosospira (Nitrosolobus Nitrosovibrio) NO2- oxidizers Nitrobacter Nitrospina Nitrococcus Nitrospira

nitrat ® nitrit ® kväveoxid ® lustgas ® kvävgas Styrning och reglering av avloppsreningsverk Denitrifikation är en andningsprocess som där nitrat omvandlas till kvävgas i flera komplicerade steg inom en och samma bakteriecell: nitrat ® nitrit ® kväveoxid ® lustgas ® kvävgas (NO3- ® NO2- ® NO ® N2O ® N2)

Denitrification: anaerobic respiration Organic compound CO2 Biosynthesis Carbon flow NO3-, (NO2-, N2O) Electron flow ATP

Denitrification Denitrification is a respiratory process where oxidized nitrogen compounds (NO3-, NO2) are reduced stepwise to gaseous end products (NO, N2O, N2): Cytoplasma H+ NADH2 NAD+ Proton motive force NO2- NO3- nar nor 2e- 2e- 2e- e- nir nos NO3- NO N2O Periplasma NO2- NO N2O N2

More than 50 genera and 130 species of denitrifying bacteria… Archaea: Extreme halophiles, Halobacterium Proteobacteria (α, β, γ): Phototrophic bacteria, Rhodobacter Budding bacteria, Hyphomicrobium, Blastobacter Helical bacteria, Azospirillum, Campylobacter Nitrogen fixing bacteria, Rhizobium Ammonia oxidizing bacteria, Nitrosomonas Gram negative cocci, Paracoccus, Neisseria Chemoautotrophs, Thiobacillus, Beggiatoa Others, Alcaligenes, Pseudomonas, Moraxella, Flavobacterium Gram positives: Spore forming, Bacillus Non-spore forming, Corynebacterium

Nitrifikation Denitrifikation - V V V Redox Glukos 2 ATP Glukolys 2 NADH 2 Pyruvat V V 8 NADH 2 FADH 2 GTP 6 CO2 Citronsyra cykeln V NADH ATP NH4+ FADH ATP NO2- ATP NO3- NO2- NO N2O N2 O2 H20 +

Nitrifierande bakterier Denitrifierande bakterier Nitrifierare finns i mark och vatten Bara några få arter Nitrifikation är två energigivande processer som utförs av två olika grupper av bakterier Nitrifierare växer långsamt Denitrifierare finns nästan överallt Många bakteriesläkten Denitrifikation är en alternativ andningsprocess i frånvaro av syre Denitrifierare är växer oftast snabbt

Efterdenitrifikation för biologisk kväveavskiljning Fördenitrifikation för biologisk kväveavskiljning

Effekt av extern kolkälla på kvävereningen 1. Kvävereningsgrad (%): 2. Denitrifikastionskapacitet: Tid (dagar) Tid (dagar) R = Fördenitrifikation utan extern kolkälla E = Fördenitrifikation med etanoltillsats

Intermittent dosering av etanol i en fördenitrifikationsprocess

Dissimilatory nitratreduction to ammonium (DNRA) N-cycle Denitrification N2 AIR SOIL/WATER N-fixation N2O NO NO2- Anammox Organic nitrogen org-NH2 N2H2 Assimilation Assimilation NH2OH Mineralization NH3 NO2- NO3- Nitrification Dissimilatory nitratreduction to ammonium (DNRA)

Anoxic Ammonia Oxidation: Anammox Uncharacterized organisms from wastewater treatment or nitrate rich sludge have beeen shown to oxidize ammonia to N2 (1995). The reaction is nitrate or nitrite dependent. 5NH4+ + 3NO2- 4N2 + 6H2O + 2H+ The organisms grow autotrophically using CO2.

Communities in sediments Denitrification in a wetland for N-removal Ekeby Constructed Wetland Communities in sediments Total area: 36 ha Flow: ~45000m3/day

Water-flow paths

Denitrification rates Multiple regressions:

Plants affect denitrification µg N/g DW/h

Plant effects in sediment Typha and Fragmites select nosZ communities Seasonal differences Plant effects in sediment (Ruiz et al., 2008, submitted)

Biological phosphorus removal ANAEROBIC AEROBIC Short chain fatty acids Energy CO2+H2O Energy Phosphate Phosphate O2 Energy is conserved as poly- phosphate granules. Uptake of PO43-. Consumption of stored products (PHB). Energy consumption for uptake of soluble organics. ATP and PO43- is released.

Biological phosphorus removal Recirculation of NO3- ANAEROBIC REACTOR AEROBIC REACTOR SEDIMENTATION Energy Denitrification PO43- O2 CO2+H2O Energy Organics PO43-

PHB synthesis & degradation Acetoacetate ß-hyroxybutyryl-CoA ß-hydroxybutyrate Acetoacetyl-CoA Poly-ß-hyroxybutyrate (PHB) Acetic acid Acetyl-CoA

Sedimentering Flocken är fundamentet i aktivt slam. Snabb och effektiv sedimentering Icke sedimenterbara partiklar adorberas till flocken. Biologisk aktivitet är koncentrerad

Flockar skapas av flera olika sorters mikroorganismer. Slemproducerande bakterier “klistrar” ihop flocken Filamentbildande bakterier är flockens “armering”. Bakterier är en förutsättning för flockbildning. Flockbildande förmåga är självreglerande i systemet.

Sedimenteringsproblem som beror på mikroorganismer   Sedimenteringsproblem som beror på mikroorganismer Problem Orsak Konsekvens 1. Dispergerad tillväxt Inga riktiga flockar bildas då mikroorganismerna förekommer som enskilda celler Utgående vatten är grumligt, dålig sedimentering 2. Mikroflockar Små, svaga flockar som lätt slås sönder. Uppstår då BOD i inkommande vatten är låg i förhållande till SS-halten Utgående vatten är grumligt, lågt SVI 3. Flytslam Spontan denitrifikation i sedimenteringsbassängerna vid långa uppehållstider Slamtäcke i sedimenteringsbassänger  

Sedimenteringsproblem som beror på mikroorganismer   Sedimenteringsproblem som beror på mikroorganismer Problem Orsak Konsekvens 4. Viskös slamsvällning Mycket extracellulära polymerer. Vanligt i verk för industriellt avloppsvatten med låg halt av fosfor eller kväve Dålig sedimentering, slam i utgående vatten 5. Filamentös slamsvällning Mycket filamentbildande bakterier som sammanbinder flockar eller skapar flockar med hålrum, t ex Microthrix Högt SVI, och i svåra fall slamflykt, men klar vattenfas 6. Skumning Hydrofoba, skumbildande bakterier tex Nocardia och Microthrix Stabilt skum på ytan av bassänger, slam i utgående vatten, skumning i rötkamrarna, hälsorisk  

Exempel på slamsvällning

Filamentous bacteria (“Microthrix parvicella”) in activated sludge flocs

Filamentbildande bakterier   Filamentbildande bakterier Det finns ca 30 kända filamentbildare i ASP 10 st står för 90 % av incidenterna Geografiska skillnader Få har "riktiga" namn Slamsvällning Skumbildning ”Microthrix parvicella” Microthrix parvicella” ”Nostocoida limicola” Nocardia eller Nocardia amarae-liknande organismer (NALO) Typ 021N Typ 0803 Aktinomyceter Thiothrix  

    Vad skall man göra? Lär känna slammet för att hålla koll på filamenten: Bestäm slamvolymindex (SVI) SVI>150 indikerar risk!    

Vad skall man göra? 2. Mikroskopera slammet regelbundet och bestäm     Vad skall man göra? 2. Mikroskopera slammet regelbundet och bestäm a) filamenthalt b) typ av filament    

Filamentbildande mikroorganismer i aktivslamflockar

  Vad skall man göra? De vanligaste sätten att förska hålla nere filamenthalten är att: 1. Minska slamåldern 2. Öka eller minska luftningen. 3. Införa selektorer/kontaktzoner. 4. Bekämpa med toxiska ämnen. Ingen av dessa metoder är generellt tillförlitliga. Kunskapen om filamentbildande bakteriers svar olika parametrar är bristfällig.  

Minskad filamenthalt efter ozonbehandling

Bättre slamkvalitet – oförändrad N-rening efter ozonbehandling