Polymerase Chain Reaction Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell Annica.Nordvall@ki.se

Polymerase Chain Reaction Kary Mullis f.1944 Presenterade PCR i Science 1985 Nobelpriset i kemi 1993 Kary mullis

Vad är PCR? Kopieringsmaskin för DNA? Kan påvisa att ett prov innehåller en viss gen

Varför var PCR revolutionerande? Kan kopiera EN SPECIFIK DNA-sekvens bland tusen andra gener Snabb (jämfört med genkloning) Känslig kan detektera DNA från enstaka celler Robust kan detektera DNA från fossila prover

Repetition: syntes av ny sträng Templat: ssDNA som fungerar som mall för den nya strängen Primer: för att starta DNA-syntesen Nukleotider(dNTP´s): utgör ”byggstenar” i DNA DNA-polymeras: enzym som bildar fosfodiesterbindning mellan 5´P och 3´OH

Vad behöver man i röret? Templat (prov med DNA) Forward primer (startsekvens) Reverse primer (startsekvens) dNTP´s (byggstenar) Taq DNA polymeras Buffert, salter Primers Nukleotider DNA www.ib.usp.br/evolucao/QTL/pcr.GIF Salt Polymeras Buffer

Vad händer i röret? Tre steg: Denaturering 95oC Annealing av primers Syntes av ny sträng 72oC Detta upprepas 20-30 ggr www.ib.usp.br/evolucao/QTL/pcr.GIF

Två primers behövs Forward primer Reverse primer Syntes ”in mot genen” DNA templat 3’ 5’ Taq Riktning på extension 5’ Taq 3’ reverse Primer 5’ 5’ forward Primer Riktning på extension 5’ 3’ Forward primer Hybridiserar uppströms om genen Reverse primer Hybridiserar nedströms om genen Syntes ”in mot genen”

Taq DNA polymeras Värmestabilt Optimalt vid 72 °C Adderar nukleotider komplementära till templatsträngen Dubbelsträngad DNA bildas Syntes från 5´till 3´ http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.polymerase.jpg http://www.cinnagen.com/images/smar%20taq%20dna%20polymerase.jpg

Amplifiering av målsekvens! www.ib.usp.br/evolucao/QTL/pcr.GIF Nästa bild: fig. 1 gå igenom tre cykler. http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

Resultat Området mellan primrarna; målområdet, ”target” amplifieras exponentiellt x2 x2 x2 x2 osv…. Efter 30 cykler har man fått ca 1 x 109 kopior av målområdet

Detektion av PCR-produkt Gelelektrofores Separation av DNA Färgning av DNA Alt: Realtids- PCR

Vad betyder ett band i gelen Det har bildats DNA-molekyler vid PCR-reaktionen. Primrarna måste ha bundit till DNA i provet Det finns sekvenser som är komplementära till primrarna Slutsats: Vi har påvisat att vårt mål-DNA fanns i provet

Tillämpningar Diagnos av bakt/virusinfektion Rättskemiska analyser Diagnos av ärftliga sjukdomar Sekvensering Kloning Kvantifiering av genuttryck (RT-PCR) Med mera!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Begränsningar? Man måste känna till sekvensen på båda sidor om den DNA-sekvens man vill amplifiera Kan ej amplifiera långa gener

Problem vid PCR Ospecifika produkter Kontamination Inhibition

Optimering av PCR-reaktion Val av primerpar Annealingtemperaturen (beror på primers) Mg2+-koncentration

Ospecifika produkter Vad har hänt? Hur kan det bildas flera produkter?

Primerlängd 8-mer ger statistiskt 46000 möjliga sekvenser att hybridisera till i humana genomet 17-mer har 1 chans på 17179869184 bp att slumpmässigt hitta en komplementär sekvens Fig. 11.5 Brown Gene Cloning

Kontamination ”Carry-over” kontamination från ett amplifierat positivt prov till ett nytt prov En aerosoldroppe kan innehålla 500 kopior av målområdet Efter amplifiering har man fått miljoner kopior; falskt positivt prov För att upptäcka ev. kontaminering körs en negativ kontroll (utan templat DNA) Positivt prov Negativt prov kontamination

Separata rum DNA extraktion prePCR rum (renrum) PCR rum

Inhibering Rester från prov eller DNA-extraktion kan inhibera PCR-reaktionen Risk för falskt negativa prov Intern kontroll tillsätts, om den inte amplifieras tyder det på inhibering PCR-film

Brister med traditionell PCR Separata steg för amplifiering och detektion; risk för kontaminering Långsam, svår att automatisera Mäter vid slutpunkt; osäker kvantif. Svårt att jämföra effektivitet vid olika PCR-reaktioner

Realtids-PCR Mha fluorescerande molekyler kan man detektera PCR-produkter varje cykel Mätning av PCR-produkter under den exponentiella fasen ger ett säkrare värde än mätning efter att alla cykler körts (end point)

End point/Real time Konventionell PCR Realtidsmätning Analyserar produkten vid slutpunkt Realtidsmätning Bildad produkt detekteras med fluorimeter Mäter PCR-produkt vid varje cykel http://www.lightcycler-online.com/ lc_principles/lc_principles_ind.htm

CT = Cykel vid tröskelvärde Exponentiell fas. Varje cykel: 2x DNA Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden CT=den cykel när signalen passerar ”tröskeln” Ju mer mål-DNA desto lägre CT (BioRad)

Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering 96 replikat av identisk reaktion Slutlig mängd varierar VARFÖR? Tröskelvärde (CT) varierar inte (Fig från BioRad)

Realtids-PCR iCycler BioRad, mikrotiterplattor LightCycler Roche, kapillärer Nov 2005 Eppendorf lanserar Mastercykler ep realplex ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor

Realtids-PCR Fördelar Lättare att undvika kontamination Behöver ej öppna röret för detektion Säkrare kvantifiering av mål-DNA

Realtids-PCR Tillämpningar Kvantitativ analys (Q-PCR) Ex. jmf mRNA i olika celler Multiplex PCR (flera primerpar ger flera olika PCR-produkter) Ex. detektera flera virustyper i samma prov Detektion av mutationer (med FRETprober och smältkurvsanalys)

Spel http://nobelprize.org/educational_games/chemistry/pcr/index.html 72

Länkar http://www.biointeractive.org/vlabs/index.html Gör en virtuell PCR: Gå in på nedanstående länk, http://www.biointeractive.org/vlabs/index.html Välj The Bacterial Identification Lab, Öppna dörren till labbet och kör en PCR!