Kloningsverktyg och kloning Dagens föreläsning: Definition kloning (repetition) Grundläggande begrepp (repetition) Kloningsverktyg vektorer enzymer Ett kloningsexperiment från start till mål Kapitel 5 Lodish, Molecular Cell Biology 7th ed, Henrik Ring, 2014

Kloning Amplifiering (kopiering) av ett specifikt DNA fragment till flera identiska kopior av fragmentet. DNA insatt i vektor amplifieras i bakterier. Bakterierna stryks ut på en platta och en bakterie ger upphov till en koloni som består av miljontals kloner av sig själv. Till skillnad från PCR används bakterier och inte en maskin för amplifieringen. Fördelen mot PCR är att man får ut fler kopior, man kan amplifiera längre fragment och att risken för mutationer minskar tack vare värdcellens proof reading maskineri. Nackdelen är att man inte kan amplifiera specifika DNA fragment direkt p.g.a. frånvaro av specifika primers.

Grundläggande begrepp Rekombinant DNA: sammansatt från olika källor PlasmidDNA: extrakromosomalt bakteriellt cirkulärt DNA, kan bära på t.ex. antibiotikaresistens eller annan proteinkodande gen som är fördelaktig för bakterien Vektor: bearbetad cirkulärt DNA som bär på vissa egenskaper som gör att den är lätt att arbeta med. Gör det möjligt att föra in DNA-fragment i bakterier eller eukaryota celler. Vektorn bär på delar som möjliggör amplifiering.

Olika typer av vektorer Plasmider Bakterievirus: kallas även fager eller bakteriefager Virus:t.ex. Lentivirus, Adeno-associerat virus (AAV); enkelsträngat DNA BAC/YAC:Bacterial/Yeast Artificial Chromosome. Större än en vanlig plasmid

Vektorernas sekvensdelar ORI:origin of replication. Här startar replikationen av vektorn genom värdcellens replikationsmaskineri. MCS:multiple cloning site. Region som innehåller sekvens som är specifik för olika restriktionsenzym som inte klipper någon annanstans i vektorn. Det är i MCS som DNA fragmentet man vill klona ligeras in. ”Resistensgen”: kodar mot beta-laktamas som bryter ned ampicillin (antibiotika) Promotor: den del dit värdcellens RNApolII kan binda och initiera uttrycket av en gen (transkription) som finns i vektorn Reportergen: t.ex. GFP (green fluorescent protein)*, RFP (Red fluorescent protein) eller LacZ. Uttrycks genom värdcellen via vektorpromotor och visualiserar var vektorn uttrycks (i vilka celler vektorn är närvarande och fungerande). LacZ : kodar för beta-galaktosidas som möjliggör blå/vit screening.

Vektor ni kommer använda i lab 3, pMOSBlue

pEGFP vektor, lab 6

Enzymer Nukleaser:klyver bindningarna mellan nukleotiderna endo- klipper inuti DNA-sträng exo- klipper i ändarna Restriktionsenzym: endonukleaser som produceras av bakterier. Känner igen 4-8 bp långa specifika sekvenser som kallas restriktionssiter. Enzymet klyver båda strängarna i DNAt och lämnar antingen sticky- eller bluntends. Restriktionssitet är ofta palindrom (= samma sekvens från båda håll). EnzymRestriktions site EcoRI HindIII XmaI EcoRV

Enzymer Fosfatas:tar bort fosfatgrupper; en vektor som klyvts och fått bluntends kan återligera med sig själv och för att förhindra detta kan man tillsätta fosfatas (CIP, calf intenstine phosphatase) som tar bort fosfatgruppen i 5’. Ligas: ligerar ihop två DNA sekvenser, skapar kovalenta (atomerna delar elektroner för att fullt yttre skal) bindningar mellan två nukleinsyrasträngar. Fungerar både för sticky- och bluntends. Kräver en ände med 5’-fosfat och ATP som energikälla.

Ett kloningsexperiment Exempel: Undersöka en gens funktion genom att uttrycka den ektopiskt (på fel plats) Få celler att producera stora mängder av ett visst protein man vill använda i ett annat syfte Genterapi

Ett kloningsexperiment PCR Ligering in i vektor Transformation till bakterier Preparation av plasmidDNA för analys Restriktionsklyvning och analys på agarosgel

Transformation av rekombinant plasmid till bakterier Transformation: överföring av plasmid till bakterie, kan ske genom t.ex. elchock eller värmechock Kompetenta bakterier: har specialbehandlats för att kunna ta upp plasmider effektivt (t.ex. Ca 2+ ) Selektion: bakterier som tar upp plasmid med antibiotikaresistens kan växa på näringslösning med antibiotika medan övriga dör. pMOS vektorn tillåter så kallad blå/vit screening (mer om detta på förlabben för lab 3). Om X-gal sätts till på agarplatta kommer bakterier som tagit upp intakt (återligerad) vektor bli blå medan de bakterier som tagit upp vektor med fragment inligerat i MCS (LacZ förstörs; beta-galaktosidas klyver X-gal) blir vita.

Vektor ni kommer använda i lab 3, pMOSBlue

Preparation av plasmidDNA Koloni som selekterats fram plockas från agarplatta och odlas upp i flytande näringslösning. Därefter lyseras bakterierna med NaOH och SDS. DNAt fälls ut som ett salt genom etanol. För att försäkra sig om att ett fragment verkligen inligerats i vektorn görs en ny restriktionsklyvning för att klippa ut fragmentet. Klyvningsreaktionen körs sedan ut på en agarosgel (elektrofores) för storleksbestämning

Agarosgel-elektrofores Elektrofores: Inmärkt (t.ex. SYBRsafe) DNA sätts i en agarosgel och elektrisk spänning slås på vilket resulterar i att DNAt vandrar mot +-polen: möjliggör separation av olika stora fragment och koncentrationsuppskattning Kvantifiering: till en gel sätts en liten mängd av plasmid-preppen med okänd koncentration och en känd mängd DNA (t.ex. 1 µg). Genom visuell jämförelse mellan plasmidpreppen och DNAt med den kända mängden kan plasmidpreppen uppskattas innehålla ungefär hälften, dubbelt eller tredubbelt så mycket DNA som den kända mängden Verifiering: en viss volym av plasmidpreppen sätts ut i en brunn, i en annan sätts en stege ut med fragment med olika storlek och kända koncentrationer. Är min plasmid av rätt förväntad storlek? Klyvdes det ut något fragment från plasmiden?

Exempel: Du har ligerat in ett 1000 bp stort PCR-fragment i en 3000 bp stor vektor. Den rekombinanta plasmiden transformeras till bakterier, som odlas upp under selektion och plasmidDNA preppas fram. Du har nu klyvt ut ditt fragment med två restriktionsenzym och undrar hur mycket mängd (ng) fragment kloningen gav totalt. PlamidDNAt har en totalvolym på 100 µl och du satte ut 10 µl på agarosgelen. Den stege du satte till (5 µl) ses nedan. 1µg (10µl) av GeneRuler DNA Ladder Mix innehåller: 120ng av 1000bp fragmentet 120 ng av 3000bp fragmentet. 1.Jämför intensitet mellan ditt 1000 bp fragment och stegens, låt säga 3 gånger starkare. 2.På gelen finns 60 ng av 1000 bp stegefragmentet, alltså har du satt ut ___ ng plasmidDNA fragment 3.Du satte ut 10 µl av 100 µl DNAprepp, således fick du totalt ut ___ ng av ditt DNA fragment

Kloningsverktyg och kloning Dagens föreläsning: Definition kloning (repetition) Grundläggande begrepp (repetition) Kloningsverktyg vektorer enzymer Ett kloningsexperiment från start till mål Kapitel 5 Lodish, Molecular Cell Biology 7th ed, 2013.