Projektlab Thomas Österberg Martin Hyvönen Kalle bunnfors Jonas Karlsson KB3civ.

En presentation över ämnet: "Projektlab Thomas Österberg Martin Hyvönen Kalle bunnfors Jonas Karlsson KB3civ."— Presentationens avskrift:

1 Projektlab Thomas Österberg Martin Hyvönen Kalle bunnfors Jonas Karlsson KB3civ

2 Flödesschema

3 PCR, förutsättnigar ● Polymeras: Lasses hemmagjorda ● Cykel: - Denatuering 95°C, 30 sec - Annulering 57°C, 30 sec T M för primer: 58°C resp 66°C efter första cykeln behövs ingen annuleringsfas - Enlongering: 74°C, 2 min

4 Gelanalys av PCR

5 Alkaline phosphatase Vi använde ej detta enzym pga att vi klöv vektorn och PCR produkt med hjälp av två olika restriktionsenzymer vilket leder till rätt orientering av insert samt förhindrar självligering. Därför skulle en addition av alkaline phosphatase kunna liknas vid att ha bälte på sig för att man inte litar på sina hängslen.

6 Restriktionsklyvning / Ligering Klyvning ● DNA volym: 10 μl ● NcoI: 1 μl ● HindIII: 1μl ● 10x reaktionsbuffert: 2μl ● Vatten: 6μl ● Gäller för både vektor och PCR produkt Ligering ● Renad vektor: 7 μl ● PCR produkt: 3 μl ● 2xLigation Buffer: 10 μl ● DNA ligas: 1 μl ● Vi eftersträvade 3:1 förhållande PCR produkt : vektor. Från gelen bedömmer vi att PCR- produkten finns i stort överskott och använder därför all Vektor och späder sedan med pcr till 10 μl total volym DNA.

7 Resultat

8 Slutsats ● Om vi lyckats klona in vårt framgment i vår vektor samt transformerat in denna så bör vi finna ett band som har vandrat något kortare än vektorbandet i tidigare kontrollgel. ● Den bakterie som vi ej ser plasmiden i fråga på bör ha den ickemodifierade plasmiden begravd i det breda bandet då den är lättare och bör ha vandrat längre.