Reglering av virulensegenskaper Johan Bylund Tel 342 46 85 johan.bylund@rheuma.gu.se

Virulens? # ” The capacity of a microorganism to cause disease.” -beror på flera olika faktorer; virulensfaktorer värdens immunförsvar övriga värdfaktorer antalet infekterande organismer etc. # Virulenta mikroorganismer kan delas in i: Patogener: är generellt virulenta i en befolkning Opportunister: är normalt ej virulenta (t.ex normalflora), men kan orsaka sjukdom i vissa personer och/eller vid vissa förhållanden (t.ex nedsatt immunförsvar).

Reglering av virulensegenskaper # Oftast reglering av genuttryck -Hur vet bakterien att den håller på och infekterar? # Enkla signaler, miljöförändringar; tex. -temp -osmolaritet -pH -gaskoncentrationer (CO2, O2) -koncentrationer av olika nutrienter –speciellt järn # Ibland också mer komplicerade signaler; -immunförvarskomponenter (tex. fria radikaler, komplementfaktorer) -genererade av intilliggande bakterier, sk. quorom sensing Faktorer som främjar överlevnad i värden är ofta helt värdelösa (tom. nackdel) ute i naturen, därför måste många virulensegenskaper regleras.

LYTISK INFEKTION--LYSOGENI

INTEGRERING AV TEMPERAT FAG Många bakteriella virulensgener kommer ursprungligen från bakteriofager, vars DNA inkorporerats i bakteriens DNA. Är dessa plasmidkodade kan de dessutom spridas mellan olika bakterier/arter, sk. horizontal transfer. profag

PATHOGENICITY ISLANDS # Virulensgener som är fysiskt närliggande på kromosomen # Finns i patogena stammar, men inte i avirulenta # Ofta flankerade av bakteriofag-specifika gener som gör elementet ”lättflyktigt” # Annat GC-innehåll än övriga genomet Pathogenicity Islands (PAIs) are a distinct class of genomic islands which are acquired by horizontal transfer. PAIs are incorporated in the genome of pathogenic microorganisms but are usually absent from genomes of non-pathogenic organisms of the same or closely related species. PAIs occupy relatively large genomic regions ranging from 10 – 200 kb and encode genes which contribute to the virulence of the respective pathogen. Typical examples are adherence factors, toxins, iron uptake systems, invasion factors and secretion systems.

DIFTERITOXIN: Reglering med järn Järn ackumuleras i bakterien mha. järnsideroforer DtxR= regleringselement som aktiveras då den binder järn. DtxR-Fe binder och stänger av produktionen av: toxin dessa gener har identiska promotor- regioner # Då överflöd av järn finns (dvs. utanför värddjur) stängs produktionen av både sideroforer och toxin av. Corynebacterium diphtheriae: ger difteri (öm hals, rodnad o svullnader i huden) –alla symptom beroende på difteritoxinet. Detta toxin är fagkodat och ligger bakom en promotorregion som är identisk med Fe-sideroforrepressor promotorn. Järnet tas upp mha sideroforer och järnet binder o aktiverar en repressor som då stänger av transkriptionen av både sideroforer och toxin. The diphtheria toxin causes the death eukaryotic cells and tissues by inhibition protein synthesis in the cells

URINVÄGSINFEKTIONER # Går nerifrån o upp, ju högre upp desto värre. # Oftast endogena bakterier (normalflora) som kommit ”fel” tex. E. coli eller enterococcer (från tarmen) # Adhesion är absolut nödvändig för att infektionen ska få fäste och kunna ”klättra” uppåt Fimbrier: P-fimbrie Typ1-fimbrie Typiskt exempel på hur normalflorebakterier ”på fel plats” kan orsaka sjukdom

FIMBRIER/PILI HOS E. COLI Typ1 P Binder till glykoprotein Binder till glykolipid

FASVARIATION AV PAP (P-fimbrien) Fasvariation: ON (fimbrie+) eller OFF (fimbrie-), varianter i en mixad population. Sker här epigenetiskt, dvs UTAN genrearrangemang. PAP operonet kodar för 9 gener som ger struktur, sammansättning och uttryck av adhesinet Mkt komplex reglering, involverande bla adenosin-metylering Dam metylerar LRP inhiberar metylering Uttrycken av dessa styrs av miljöfaktorer

FASVARIATION FÖR TYP 1 FIMBRIEN Fas “off” Fas “on” inverterbar fimbrie promotor stukturgen för fimbrie Enklare reglering än PAP Styrs av orienteringen på en 9bp inverterbar promotor. 2 rekombinaser (och övriga co-faktorer) styr inverteringen -dessa regleras av miljöfaktorer. Adhesinerna är också mkt antigena  fas OFF undviker antikroppar (men kan inte fästa)

BAKTERIE-VÄRDCELLS-INTERAKTION Neisseria gonorrhoeae Pilus: Ansvarar för den initiala bindningen Yttre membranprotein: Ger en tät kontakt med värdcellen. Porin i det yttre membranet: Hämmar F-L fusion G-, kapsel, infekterar främst könsslemhinnor. Lokal inflammation/varbildning, kan bli septisk o ge artrit obligata humana patogener! Kan ge fosterblindhet, missfall och infertilitet. Pilin protein (pil gene complex) på ytan –antigenisk variation (ingen immunitet, dåliga vacciner) -fimbrie porin i yttermembranet, antigenisk variation. Opa proteiner: binder till epitelceller, multipla alleler i samma isolat rekombination Värdcell

PILIN: STRUKTUR OCH ANTIGEN VARIATION Protein nivå = variabla delar (>106 varianter) Rekombination på DNA nivå Antigenvariation: effektivt sätt att undkomma det specifika immunförsvaret –inte ON/OFF, snarare olika varianter! Massor av variabla delar, på olika ställen i genomet. Dessa uttrycks ej (silent), men kan rekombineras in till ett aktivt site (bakom en promotor) De nya varianterna kan sedan transformeras till övriga individer o på så sätt sprida varianten. Slutprodukt Den nya varianten kan också transformeras in i andra individer

NESSERIA GONORRHOEAE: REGLERING AV DET YTTRE MEMBRANPROTEINET P II (opa) SV=semivariabel HV=hypervariabel 12 olika alleler, på olika ställen i genomet, av opa, bara 1 el. några få uttrycks åt gången Skiljer sig map. hur många CTCTT repeats som föregår genen  ger in/out of frame el. missense Om n är delbart på 3  fullängd SV=semivariable HV=hypervariabel

REGLERING AV VIRULENSGENER HOS LISTERIA MONOCYTOGENES prfA -- en aktivator som är temperaturreglerad - hela systemet är kromosomalt lokaliserat Fosfolipaser = PI-PLC; plcA PC-PLC; plcB intracellulär patogen, genom smittad mat G+, hjärnhinneinflammation, listerios, sepsis kan orsaka missfall Aktin polymerisering =ActA 9kB Pathogenicity island Zn beroende metalloproteas =mpl Hemolysin = hly = Listerolysin = LLO Regleringen av internalinA (InlA) är inte känd, ligger utanför PAI

hjälper också till att bryta sönder vacuolmembran L. MONOCYTOGENES LLO PC-PLC, fosfolipas; hjälper också till att bryta sönder vacuolmembran Internalin; upptag Listerolysin (LLO); bryter ner vacuolmembran så att bakterien frisätts i cytoplasman Användningsområde för några PAI kodade virulensfaktorer ActA; polymeriserar actin och pressar bakterien genom membran actinsvans

Bordetella pertussis Adhesion via t.ex Fha= filamentös hemagglutinin Kikhosta, G-, infekterar i princip bara barn och är oerhört smittsam –sprider bakterien genom uthostningarna! PtX inhiberar G-protein kopplad signalering, ”förlamar” epitelcellerna m. cilier kan leda till sekundärinfektioner. Adhesion via t.ex Fha= filamentös hemagglutinin Toxisk effekt via t.ex Ptx= pertussistoxin även andra toxiner förekommer

REGLERING AV VIRULENSGENER HOS BORDETELLA PERTUSSIS 2+ Fosforyleras vid hög temperatur, Mg och niacin + - + + Virulensgenerna har koordinerat uttryck, styrs av en master regulator som i sin tur kan sparkas igång av miljöfaktorer, tex. temp o Mg2+ Fur: Ferric Uptake Receptor: troligtvis viktigt för regleringen, dvs. järn spelar roll igen Virulensgenerna är rena kromosomala gener, dvs. kommer INTE från nån fag! Bvg = Bordetella virulens gener Vag= virulens activated gener Vrg = virulens repressed genes

INFEKTION MED YERSINIA BAKTERIER Loppa Hud Pestis, digerdöden, via loppor (men oxå droppsmitta). Fortfarande förekommande, även i västvärden (tex. texas), bältor fungerar som reservoarer! Enterocolitica/pseudotuberculosis; via vatten magproblem, kan ge sepsis Vissa gemensamma virulensfaktorer

VIRULENSPLASMID HOS YERSINIA En eller flera virulensplasmider –absolut avgörande för virulensen! Kan spridas via horizontal transfer Några enstaka virulensgener ligger på kromosomen Yad = Yersinia adhesion proteins Yop = Yersinia outer (membrane) proteins Ysc = Yersinia secretion proteins Lcr = Regulatory proteins

YERSINIA PROTEINERS FUNKTION Måste in i värdcellen Bara exempel, det finns många fler Yop= Yersinia Outer membrane Protein, påverkar ofta eukaryota värdceller –måste injiceras in i dem

TYPIII SEKRETION HOS YERSINIA Mycket komplext system, liknar en kanyl som skjuter in Yop ”toxiner” in i värdceller –tvärs över 3 membran. Tight reglering av expression och funktion YopB –formar en por i det eukaryota membranet

UTTRYCK AV YOP E I YERSINIA DIC LUMINESCENCE PSEUDOFÄRGAD YopE WT YopB mutant Även direkt kontakt med värdcellen (vid rätt temperatur) triggar Yop expression. Även Ca2+ koncentrationer av betydelse (okänd mekanism) –yop uttryck vid låga konc. YopE YopB (poren) behövs för injektion

UPPTAG AV YERISNIA Yop H mutant YopH: antifagocytos Yop H vildtyp Upptag sker via komplexa fosforyleringar i den eukaryota cellen. YopH e ett fosfatas –stör upptagsprocessen. YopH mutanten binder normalt –och tillverkar Yop’arna, men kan inte motstå fagocytos.

TEMPERATUR REGLERING Yop proteiner Temperaturen är avgörande för regleringen av Yop proteiner, inget uttryck i loppan Vid 26 C , stor produktion av virR--polymer som är aktiv repressor Vid 37 C, liten produktion -- monomer som är inaktiv som repressor

Quorum sensing # Bakterier kan bete sig som multicellulära organismer -intercellulär kommunikation via extracellulära ”feromoner” -koordinerat beteende # Frisättning av små, lösliga, extracellulära signalmolekyler, som vid en kritisk koncentration aktiverar bakteriell gentranskription # Ett sätt att känna av populationsstorlek # Reglerar gener som påverkar bla; -biofilmformation -toxinproduktion -antibiotikasyntes -flagelluttryck

Pseudomonas biofilmer # Sker ofta i lungan hos tex. CF patienter # Skyddar bakterierna från; antibiotika antikroppar fagocyter # Biofilmen är inbäddad i Alginat =slemmig polysaccharid. Bidrar starkt till nedsättning av lungfunktionen, både andningsmässigt och vad gäller ciliers rensningsfunktion # Biofilmer förekommer även på inplantat av olika slag samt vid tandinfektioner

Potential QS targets for the inhibition of P. aeruginosa virulence Potential QS targets for the inhibition of P. aeruginosa virulence. For simplicity, only the las QS system is shown; however, similar mechanisms could be used to inhibit the rhl system as well. (a) P. aeruginosa LasI synthase utilizes S-adenosyl methionine (SAM) and acyl-ACP to form 3O-C12-HSL. As the density of the bacteria, and thus of 3O-C12-HSL, increases, the 3O-C12-HSL molecule binds to the LasR regulator, resulting in dimerization, DNA binding, and transcription of multiple genes. (b) Antagonistic analogues of cognate AHLs compete for binding to LasR but do not result in activation of the protein. (c) Specific antibodies bind to AHLs as they exit the bacteria, inhibiting their re-entry and thus inhibiting activation of LasR as well as their interaction with host cells. (d) Lactonases degrade AHLs as they leave the bacteria, thus inhibiting their activation of LasR and host cells. (e) Targeting the expression of LasI substrates would prevent the production of 3O-C12-HSL, and thus QS activation. (f) Multiple factors have been shown to regulate lasR and lasI. Drugs that inhibit these factors would result in altered QS activation. (g) Specific antisense oligonucleotides (oligos) pair with lasR or lasI RNA and inhibit gene translation and thus protein production.