Ki67-index på bröstcancer - reproducerbarhetsstudie Lennart Mellblom Karlskrona

Proliferationsbedömning – varför? Flera studier har visat att proliferationsmarkörer utgör viktiga prognosfaktorer och är därmed viktiga faktorer för ställningstagande till och val av kompletterande behandling av bröstcancer och detta gäller även flera andra maligna tumörformer. Bröstcancer NHG 2 kan indelas i en prognostiskt gynnsam och en ogynnsam grupp med hjälp av fr. a. proliferationsmarkörer.

Proliferationsbedömning – metoder Mitosräkning Flödescytometrisk bedömning av S-fas fraktion Genuttrycksprofiler (Oncotype DX, MammaPrint ..) Thymidine-labeling index Immunhistokemisk färgning av cellcykelprotein PCNA – S-fasmarkör (co-faktor till DNA-polymeras) Ki67/MIB1 – G1-M-fas-markör, negativ under G0-fas Cyklin A – S-fasmarkör PHH3 - fosfohiston H3 – markör för sen G2 och M-fas, som är fixeringskänslig och ger c:a 80% högre värden än mitosräkning. Färgar inte pyknos eller apoptos, men tidig profas (rund positiv kärna).

Ki67/MIB1 Uttrycks under tidig G1-, S-, M- och G2-faserna, men inte under G0-fas. Når maximalt uttryck under M-fasen. Starkt nukleolinfärgning under S-fasen. Brytpunkt mellan lågproliferativ och högproliferativ tumör 15% för medelvärdesräkning och 22% för hot-spot räkning.

Cyklin A Uttrycks under hela S-fasen. Brytpunkt mellan lågproliferativ och högproliferativ tumör 8% för medelvärdesräkning och 11% (15%) för hot-spot räkning

Utskickat material i tidigare test Vävnadssnitt från bronkialcarcinoid Vävnadssnitt från magsäcks-GIST Vävnadssnitt från optimalt fixerad bit (BC1) från bröstcancer NHG 2 Vävnadssnitt från rutinmässigt fixerad bit (BC2) från bröstcancer NHG 2 (samma cancer)

Studieupplägg i tidigare test 2 glas med vardera 2 snitt (carcinoid + GIST respektive BC1 + BC2) Alla deltagande lab färgade enligt egna rutiner Alla lab bedömde enligt interna rutiner Glas skickades till NordiQC för färgning och bedömning Glas från samtliga lab skickades till DAKO och LRI för mätning på digital bild med bildanalys-system (ACIS respektive Aperio)

Bedömningsresultat, Ki67-index, tidigare utskick Lab Carcinoid GIST BC1 BC2 Metod NordiQC 2 10 35 Räkn i def yta Halmstad 8 20-25 20 Helsingborg <1 5-8 15 25 Skattn hot spot Jönköping <2 40 44 Skattning Kalmar 14 56 60 Aperio hot spot Karlskrona 1 7 30 Kristianstad 3 35-40 45 Linköping 5 Lund Malmö 13 38 Växjö 33

Delprojekt 2 - upplägg 4 bedömare (Dorthe Grabau, Vibeke Jensen, Erik Holm, Lennart Mellblom) Gemensamma bedömningsriktlinjer 2 bildanalyssystem (ACIS, Aperio) Två färgningar – DAKO – färgat i Glostrup samt Ventana färgat i Odense 12 bröstcancrar + fall från tidigare utskick (4 st)

Bedömningsriktlinjer (1/3) Bedömningen utförs på invasiv cancer inom det/de områden som har högst andel positiva cancercellkärnor/ytenhet (”hot spot”) En ”hot spot” omfattar i allmänhet minst 200 cancerceller Vid minsta tvekan om vilka områden som utgörs av invasiv cancer skall IHC för basalceller (ex p63, SMMS-1) utföras

Bedömningsriktlinjer (2/3) I vissa fall (ex riklig lymfocytinfiltration, kraftig stromareaktion) kan dubbelfärgning för Ki67 och cytokeratin underlätta bedömningen Bedömningen utförs med x40 objektiv Räkna index på c:a 200 celler. Detta kan normalt göras i 1-2 synfält Index anges med så exakt siffra som möjligt; ingen intervallbedömning

Bedömningsriktlinjer (3/3) Som positiv kärna räknades sådana där kärnfärg för DAB (brun) överstiger hematoxylinfärgen (blå). Gränsfall räknas som negativa utom när nukleol(er) är brunsvarta Räkningen skedde inom markerad ring (= ”konsensus-hotspot”) Alla snitt räknades först med den ena, sedan med den andra antikroppen (DAKO resp. Ventana)

Ki67-index, bildexempel på gränsfall Smal pil = positiv Bred pil = negativ

Preparat Tidigare fall: 1 carcinoid, 1 GIST, 2 BC NHG 2. Duktal cancer NHG 1: 2 fall Duktal cancer NHG 2: 3 fall Duktal cancer NHG 3: 2 fall Duktal cancer NHG 3, lymfocytrik: 2 fall Lobulär cancer: 3 fall

Dataredovisning för spridning av Ki67-index Aperios bildanalysprogram är anpassat för bedömning av ER och PR i tre olika intensitetsnivåer, ej för Ki67 Bedömning av Ki67 har utförts av morfologiskt oerfaren person Aperiodata utfaller i detta test med sämre resultat än manuella bedömningar och DAKO:s ACIS Jag har därför valt att ej redovisa Aperiodata när maximala spridningen anges

Statistik (P-O Bendahl) Jämförelse mellan de båda antikropparna visar ett något högre värde för prover färgade med Ventana (1,9-4,0% för manuella bedömningar och 0,3% för ACIS) vid parat t-test för varje bedömare Parvisa korrelationer för kontinuerlig skala mellan de 4 bedömarna varierar mellan 0.94 och 0.98 Korrelationen på kontinuerlig skala mellan de 4 bedömarna å ena sidan och ACIS å andra sidan varierar mellan 0.93 och 0.96

Kappavärdets tolkning Kappa > 0,8 = very good Kappa 0,6 – 0,8 = good Kappa 0,4 -0,6 = moderate Kappa 0,2 – 0,4 = fare Kappa < 0,2 = poor

Statistik (P-O Bendahl) Grad av överensstämmelse efter kategorisering <20% vs >=20% är 100% för bedömare C/D och bedömare B/ACIS med DAKO-ak; ingen perfekt överensstämmelse för något par med Ventana-ak Den genomsnittliga parvisa överensstämmelsen (inkl Aperiodata) vid kategorisering är 93% för DAKO-ak och 85% för Ventana-ak Medelkappa över alla parvisa jämförelser (inkl Aperiodata) efter kategorisering är 0.85 för DAKO-ak och 0.69 för Ventana-ak

Ki67-överensstämmelse i SweQA- utskicket 2010 12 fall bedömdes av 26 laboratorier Kategorisering i 4 grupper (0-10, 11-20, 21-50 och >50%) Genomsnittlig överensstämmelse 59% Genomsnittligt kappa 0.4 Genomsnittligt kappa vid kategorisering i 2 nivåer vid 20% = 0.54 (jfr 0.85 med DAKO-ak och 0,69 för Ventana-ak))

Kappavärden vid kategorisering i 4 nivåer DAKO-ak för A-D+ACIS: Medelkappa 0.6 (jfr 0.4) DAKO-ak för A-D: Medelkappa 0.62 Ventana-ak för A-D+ACIS: Medelkappa 0.58 Ventana-ak för A-D: Medelkappa 0.56

Spridningsdiagram bedömare C/D delningsgräns vid 20%

Ki67-fördelning A-D+ACIS

Statistik (P-O Bendahl) sammanfattande kommentarer De manuella bedömarna (A-D) har god överensstämmelse oavsett antikropp ACIS-systemet ger Ki67-värden som ligger mycket närmare manuella bedömningar än Aperios system för ER/PR Ventana-ak ger något högre Ki67-värden än DAKO-ak Den parvisa överensstämmelsen är bättre för DAKO än för Ventana

Spridning av Ki67-index för manuella bedömningar i nuvarande (2x4 = 8) och tidigare (11 x1 = 11) prover från samma kloss; alla färgningar Tumör Lägst nuvarande Högst tidigare Carcinoid 4 8 <1 3 GIST 14 19 <2 BC1 44 59 15 56 BC2 50 68 20 60

Spridning av Ki67-index för ACIS-bedömning i nuvarande (2 glas) och tidigare (7-11 glas) prover från samma kloss; alla färgningar Tumör Lägst denna gång Högst tidigare test Carcinoid Trasigt glas 7 1 6 GIST 13 4 10 BC1 52 61 11 37 BC2 67 74 23 63

Spridning av Ki67-index för alla bedömningar i nuvarande prover NHG 1; alla färgningar Klossnr Manuell min 8 bed. Manuell max ACIS min 2 bed. ACIS max 11 12 20 13 30 17 18

Spridning av Ki67-index för alla bedömningar i nuvarande prover NHG 2; alla färgningar Klossnr Manuell min 8 bed. Manuell max ACIS min 2 bed. ACIS max 1 9 19 14 15 4 36 54 37 38 16 62 84 68 71

Spridning av Ki67-index för alla bedömningar i nuvarande prover NHG 3; alla färgningar Klossnr Manuell min 8 bed. Manuell max ACIS min 2 bed. ACIS max 2 65 92 77 78 15 8 25 10 16

Spridning av Ki67-index för alla bedömningar i nuvarande prover NHG 3, lymfocytrik; alla färgningar Klossnr Manuell min 8 bed. Manuell max ACIS min 2 bed. ACIS max 12 76 95 72 75 14 43 83 51 52

Spridning av Ki67-index för alla bedömningar i nuvarande prover lobulär ca; alla färgningar Klossnr Manuell min 8 bed. Manuell max ACIS min 2 bed. ACIS max 3 12 46 31 35 9 7 19 8 10 65 45

Sammanfattning Standardiserad färgning och gemensamma bedömningsriktlinjer kan öka graden av samstämmighet till en kliniskt användbar nivå vid bedömning av Ki67-index ACIS (och möjligen fler bildanalyssystem) har hög grad av överensstämmelse med manuella beräkningar och klarar lobulära såväl som lymfocytrika cancrar minst lika bra som manuell beräkning

Ki67-rapportering Det finns önskemål att rapportera enligt kontinuerlig skala I dag delas tumörer in i två grupper med Ki67-index c:a 20% som delningsvärde ER och PgR rapporteras i 4 intervaller (<1, 1-10, 11-50, >50)

KI67-index - räkneprinciper Konsekutiv räkning av alla celler i ett x40 synfält Konsekutiv räkning av 200 celler i ett x40 synfält Räkning med hjälp av 10 x 10 grid Räkning med hjälp av Millerruta Räkning av alla celler inom ett definierat mikroområde Räkning inom flera synfält Räkning av >200 celler vid gränsvärde (10 – 30) ……..

Kvantitativa IHC-bedömningar ER PgR HER2 Ki67 p53 p16 ……

Framtida immunogruppsfrågor Kvantitativa IHC-bedömningar exklusive SweQA-bröstpanelen Rutiner för verifiering av ny ak för IHC-analys Rutiner för driftkontroller av IHC-analyser

EBBE och hans farfar tackar för uppmärksamheten.