Separationsmetoder

Separationsmetoder Kromatografi, gas (GC) eller vätska (LC) Elektrofores Masspektrometri

Kromatografi Gaskromatografi, GC Separation av t.ex. alkoholer, fetter, … Vätskekromatografi, LC (t.ex HPLC) Separation av vattenlösliga ämnen som ej tål höga temperaturer t.ex. proteiner, DNA, …

Kromatografi Provet passerar en kolonn som separerar partiklarna med avseende på storlek eller kemiska egenskaper beroende på kolonn- materialets egenskaper

Separationen sker genom att en rörlig fas med de lösta ämnena rör sig genom en fast fas (stationär fas). Den rörliga fasen kan vara i vätske- eller gasform. Den stationära fasen kan vara i fast eller vätskeform (gel)

Gaskromatograf http://www.youtube.com/watch?v=q0pM-k0SvOQ&feature=related

FID detektor

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Affinitetskromatografi

Kromatogram från HPLC

Diod-Array detektor

Elektrofores

Elektrofores Separation av t.ex. proteiner eller DNA fragment efter storlek och ladding. Bestämning av DNA sekvens, sekvensering

Elektrofores Joner separeras i en gel genom att de utsätts för ett elektriskt fält. Jonerna kan separeras på grund av sin laddning och storlek.

Sekvensering

Kapillär-elektrofores

Mass spektrometri MS Separation av joner med avseende på massa och laddning

Mass -spektrometer

Mass-spektrometri Historiskt perspektiv J.J Thompson : Upptäckte att Neon hade flera isotoper c:a 1900. Fragmentering av molekyler. Dempster : konstruerade första ms med riktningsfokusering c.a 1920, elektron källa. Användes t.ex vid anrikning av U-235 för första Atombomben.

Mass- spektrometri (MS) Bestämma massan på molekyler och atomer Framställa fragment i gasform av provet Mäta massan på fragmenten. Fragmenten ger ett fingeravtryck av provet Studera relativa andelen av olika fragmentens massor. Studera relativa andelen av olika isotoper.

Blockschema för Mass -spektrometer Vakuum Prov från HPLC Presentations enhet Analysator Detektor Jonkälla Registrerar pulsen ger molekylel laddning acceleration separation

Joniseringsmetod Electron Impact Ionization

Exempel på vanliga fragment

Mass spektrum av benzyl alkohol

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Joniseringsmetoder Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Mass-spektrum

Joniseringmetoder Electronspray (ESI) 1 – 5kV spänning då areosolen lämnar kapillären. ”dropparna” torkar in (”hyperladdning”) Coulombic explosion Jonerna i gasfas

Joniseringsmetod Electron spray

”rå-spektrum” från ESI-MS

Analysmetoder (MALDI) ToF

Analysmetoder Quadropole mass filter -(U+Vcos(wt)) +(U +Vcos(wt))

Analysmetoder för MS Acceleration i elektriskt fält Böjning i magnetfält F= q*v * B E + 4000V 0 V m/q = B * r/v F = mv2/r + F + + + + v X X X X X E r F d B F = q*E v mv2/2 = q* U F v2 = q* V*2/m

Analysmetoder magnetsektor instrument (MS) massan = m r laddningen = q r är unik för ett värde på kvoten m/q

GCMS homepage.univie.ac.at/Wolfgang.Werther/Folie1.JPG

GC-MS system

Historiskt perspektiv GC-MS mitten på 50-talet. Test av läkemedel, hormoner, föroreningar,… MALDI (1985), ES-MS (1988) m.fl. har gett möjlighet att studera stora biomolekyler. (Nobelpris 2002) Kan användas vid diagnos av t.ex Malaria och Cancer (äggstock-, prostata-, bröst-)

Jonisationsmetoder Jonisations metod Typisk molekyl Prov preparation Mass range Egenskaper EI Liten flyktig GC/vätske eller fast prob -1000 Da Hård ger struktur info CI - 1000 Da Mjuk ESI Peptid/protein LC/spruta - 200 000 Da Mjuk / multi-laddad FAB Kolhydrater Prov +Matrix - 6000 Da Hårdare än ESI MALDI - 500 000 Da mjuk