Kurnik et al PNAS 2012 Frågeställning: Har laddade aminosyror en viktig roll i proteinveckningsprocessen för att t ex undvika oönskade interaktioner som leder till felaktiga strukturer? Ta bort laddningarna i proteinet S6 för att studera betydelsen av laddade aminosyror för proteinets veckning Topologin för S6 2BXJ S6 proteinet har 16 negativt och 16 positivt laddade sidokedjor som utgör 32 % av aminosyrasekvensen

Lys och Arg är muterade till Ser Kurnik et al PNAS 2012 S6WT Inga mutationer S6+1-17 Lys och Arg är muterade till Ser S6+1 Asp och Glu protoneras vid lågt pH.

viktigt att veta för att studera proteinveckningen Kurnik et al PNAS 2012 Analys av strukturen för de olika proteinvarianterna mha NMR Ett HSQC experiment visar korstoppen mellan protonen och kvävet i amidgruppen hos de individuella aminosyrorna Slutsats: Båda varianterna (S6+1-17 samt S6+1 ) har nativliknande struktur viktigt att veta för att studera proteinveckningen

Plot av kf och ku mot [GdmCl] → Chevronplot Kurnik et al PNAS 2012 Bestäm proteinstabiliteten för de tre S6 varianterna genom att bestämma hastighetskonstanten för folding (kf) och unfolding (ku) i olika [GdmCl] GdmCl är ett salt som denaturerar proteiner Chevronplot Plot av kf och ku mot [GdmCl] → Chevronplot Hur gör man detta experiment?

Konstruktion av chevronplot 1. Bestämning av hastighetskonstanten för unfolding ku vid olika [GdmCl] Späd till olika högre koncentrationer av GdmCl Denaturerat protein Nativt protein U Mät spektroskopisk förändring över tid t ex fluorescence Fluorescence N Time Unfolding: Fit single exp y = A + B*exp(kU*t)

Konstruktion av chevronplot 2. Bestämning av hastighetskonstanten för folding kf vid olika [GdmCl] Späd till olika lägre koncentrationer GdmCl Denaturerat protein Nativt protein U Fluorescence Mät spektroskopisk förändring över tid t ex fluorescence N Time Folding: Fit single exp y = A + B*exp(-kF*t)

Beräkna hastighetskonstanten för folding (kf) och unfolding (ku) i olika [GdmCl] Unfolding: Fit single exp y = A + B*exp(kU*t) Fluorescence Folding: Fit single exp y = A + B*exp(-kF*t) N Time Chevron plot mu lutningen på linjen lnku vs [GdmCl] mf lutningen på linjen lnkf vs [GdmCl] lnkFH2O = lnkfH2O + mf [GdmCl] • • • • = lnkuH2O + mu [GdmCl] • • • • ln kosb • [GdmCl] MP = [GdmCl] då ku = kf → [N] = [D] MP = (lnkfH2O - lnkuH2O)/(mu – mf) lnkUH2O

G D N Reaktions koordinat Chevron plot lnkFH2O • = lnkfH2O + mf [GdmCl] • • • = lnkuH2O + mu [GdmCl] • • ΔGH2O = -RTlnkUH2O/kFH2O • ln kosb • • [GdmCl] lnkUH2O Konstruera ett energidiagram TS (Transition state) kFH2O kUH2O mu – förändring i exponerad yta mellan N och TS mf – förändring i exponerad yta mellan D och TS mD-N – förändring i exponerat yta mellan D och N G D ΔGD-N = -RTlnkUH2O/kFH2O N Från m-värdena kan man beräkna βT som är ett mätvärde på exponerad yta i TS relativt D βT = -mf /mD-N = 1-mu/mD-N (ligger mellan 0-1) βT = 1 → TS har en kompakt N-liknande struktur βT = 0 → TS är ostrukturerad och liknar D mf mu mD-N = mu - mf Reaktions koordinat

Kurnik et al PNAS 2012 Kinetiska parametrar och proteinstabilitet från chevronplot S6WT S6+1-17 S6+1 TS Energidiagram relativt det denaturerade tillståndet D Energinivån för N bestäms från ΔGD-NH2O Höjden på aktiveringsbarriären bestäms från kf Positionerna för D, TS och N längst reaktions koordinaten är bestämda från m-värderna och normaliserade till N

Kurnik et al PNAS 2012 Borttagning av laddningar leder till att proteinet veckar sig fortare (i.e. aktiveringsenergin sänks) men det nativa tillståndet destabiliseras. Utan laddningar Med alla laddningar Frågeställning: Har laddade aminosyror en viktig roll i proteinveckningsprocessen för att t ex undvika oönskade interaktioner som leder till felaktiga strukturer? Slutsats: De laddade aminosyrorna har inte en avgörande roll i veckningsprocessen då proteinet kan vecka sig utan närvaro av laddningar. Laddade aminosyror är viktiga för proteinets löslighet samt för interaktioner och för biologisk funktion (obs! slutsats från andra experiment i artikeln). DVS Specificiteten i veckningsprocessen kontrolleras primärt av hydrofoba interaktioner och vätebindningar emedan laddningar hos proteinet är av betydelse för proteinets löslighet och bindningsegenskaper .

G D N Reaktions koordinat Hur kan man detektera om en aminosyra har bildat sina nativa kontakter i TS? TS Uppgift: Ta reda på i vilken utsträckning aminosyrorna grön, blå och lila har bildat nativa interaktioner i TS! G D N mf mu mD-N = mu - mf Mutera bort en aminosyra i taget och gör en chevronplot Reaktions koordinat

Chevron plot lnkFH2O Beräkna Φ! ln kosb [GdmCl] lnkUH2O Fersht sid 558-563 Chevron plot lnkFH2O Beräkna Φ! • • • • • • • • • • • (lnkfWT – lnkfmut) • • • • • Φ = • • • • • • • ln kosb • • (lnkfWT – lnkfmut) - (lnkuWT – lnkumut) • • • • [GdmCl] lnkUH2O Φ (lila AA bortmuterad) = 0 (påverkar inte kf) → Lila AA har inga nativa kontakter i TS Φ (blå AA bortmuterad) = 1 (kf är lägre, ku oförändrad)→ Blå AA har bildat alla nativa kontakter i TS Φ (grön AA bortmuterad) = mellan 0-1 (både kf och ku påverkas) → grön AA har bildat en del nativa kontakter i TS Vid en systematisk mutationsstudie kan man kartlägga vilka AA som har bildat struktur i TS!