Studier av genexpression Molekylärbiologi T3, HT-11 Biomedicinska analytikerprogrammet Karolinska Institutet Annica Nordvall Bodell http://images.google.se/imgres?imgurl=http://www.sanger.ac.uk/Teams/Team86/images/fig3e-full.jpg Collagen VI in human kidney, fluorescence detection

Kunskapsmål för detta avsnitt Från kursplan: förklara grundläggande principer för hur nukleinsyror kan renas och analyseras samt tolka resultat av olika analyser.

Veta vilka nivåer genexpression kan studeras på Lite mer utförligt: Veta vilka nivåer genexpression kan studeras på Förklara principen för några metoder för att studera expression på olika nivåer Eventuella för- resp. nackdelar med olika metoder (vad avgör val av metod) Några exempel på varför det kan vara intressant att studera genexpression

Varför vill man studera genexpression?

Proteinet IgF-1 produceras som svar på tillväxthormon Proteinet IgF-1 produceras som svar på tillväxthormon. För att undersöka om tex kortväxta barn har brist på funktionellt tillväxthormon skulle man kunna undersöka expressionen av IgF-1. a) Hur skulle man kunna gå tillväga? b) Om man vill behandla med tillväxthormon så vill man veta om det påverkar även annan expression. Hur skulle man kunna undersöka det?

På vilka nivåer kan genexpression studeras?

Man kan vara intresserad av om en gen uttrycks Hur mycket som uttrycks Var den uttrycks

Exempel på metoder för att studera mRNA-uttryck från specifika gener Northern blot RT-PCR (kvalitativ/ kvantitativ) In situ hybridisering (RNA protection assay)

Northern blot Rena fram RNA från celler/ vävnad (denaturating)

Ex. på resultat från Northern blot Elektrofores av total RNA från olika vävnader efter färgning med etidiumbromid Resultat efter blotting, hybridisering och detektion. Hybridisering med GAPDH probe (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase )

Reverse Transcriptase (RT)-PCR Omvandlar mRNA till cDNA i första steget sedan vanlig PCR Kan se om det uttrycks med PCR och elektrofores Kvantitativ PCR (QPCR/ Realtids PCR) (ex Taqman, Syber green)

RT-PCR

Realtids PCR (TaqMan) http://images.google.se/imgres?imgurl=http://www.servicexs.com/plaatjes/TaqMan_RT-PCR_assay.jpg http://images.google.se/imgres?imgurl=http://www.nippongene.com/pages/products/pcr/qpcr/rtcore.png

In situ hybridisering

Ex. Resultat av In situ hybridisering på vävnadssnitt Over-expression of p53 protein was observed in the adenocarcinoma immunohistochemically. Sameshima et al. World Journal of Surgical Oncology 2009 7:41   doi:10.1186/1477-7819-7-41

Vilken av de genomgångna metoderna tror ni är känsligast Vilken av de genomgångna metoderna tror ni är känsligast? Fundera på andra eventuella för- eller nackdelar med metoderna

Exempel på metoder för att studera proteinuttryck från specifika gener Western blot Immunhistokemi

Western blot

Immunohistokemi Använder antikroppar för att detektera proteiner direkt i celler eller vävnad Antikropparna (primära el sekundära) kan vara märkta med flourescens eller enzym videolänk Frozen lymphnode stained with antibodies against neuropeptide Y http://www.neuromics-antibodies.de/bilder/MO15022-1.jpg

Att studera expressionen av många gener samtidigt DNA chips (Micro array) Kräver att man har tillgång till de gensekvenser vars uttryck ska undersökas (Differential display, Subtraktionsbibliotek) Om man vill jämföra genutrycket mellan olika celltyper. Tar i efterhand reda på vilka gener som uttryckts specifikt i vissa celler

videolänk

Proteinet IgF-1 produceras som svar på tillväxthormon. För att undersöka om tex kortväxta barn har brist på funktionellt tillväxthormon skulle man kunna undersöka expressionen av IgF-1. a) Hur skulle man kunna gå tillväga? b) Om man vill behandla med tillväxthormon så vill man veta om det påverkar även annan expression. Hur skulle man kunna undersöka det?

Reporter gene assay Används för att studera promotorer eller andra reglerande sekvenser Sekvensen ligeras in i en vektor innehållande en reportergen En reportergen kodar för ett protein som lätt kan detekteras

Ex. vektor med reportergen