Validering och intern kvalitetskontroll av resistensbestämning 1

En presentation över ämnet: "Validering och intern kvalitetskontroll av resistensbestämning 1"— Presentationens avskrift:

1 Validering och intern kvalitetskontroll av resistensbestämning 1
Validering och intern kvalitetskontroll av resistensbestämning Validering av resistensbestämning med histogramanalys av konsekutiva kliniska isolat 2. Intern kvalitetssäkring med referensstammar

2 Resistensbestämning med RAF-Ms metod
I RAF-Ms resistensbestämningssystem används RAFs MIC-gränser (som i ökande utsträckning har harmoniserats med övriga Europeiska MIC-gränser) med korrelat till en metod som bygger på ISA-medium (25 ml per platta, för särskilda ändamål med tillsats av defibrinerat hästblod och Beta-NAD) och bestämda lappstyrkor (från Oxoid). Såväl metod- som substratbeskrivningar måste följas och vid införande av metoden och/eller metodproblem måste metoden kalibreras mot kända normalpopulationer.

3 Data by Hanna Odén, Clinical microbiology, Växjö, Sweden

4 > Data by Hanna Odén, Clinical microbiology, Växjö

5 Kalibrering av metod med histogramanalys (1)
RAF-M har vid fastställande av zonbrytpunkter utgått från ett stort antal populationsfördelningar (histogram-analyser) och därvid a) försökt undvika zonbrytpunkter som klyver vildtypspopulationer och b) försökt skapa en rimlig "korridor" mellan zonbrytpunkten och populationens nedre begränsning och på så sätt skapa ett visst utrymme för variation mellan och inom laboratorier.

6 Kalibrering av metod med histogramanalys (2)
RAF-Ms zonbrytpunkter är giltiga om laboratoriets zondistributioner sammanfaller med RAF-Ms. Det innebär att den nativa populationen för välkarakteriserade arter skall uppvisa en jämn Gauss-form; att huvudpopulationens median inte skall avvika mer än 2 mm från den av RAF använda; att huvudpopulationens spridning ej skall överstiga den av RAF använda.

7 Kalibrering av metod med histogramanalys (2)
RAF-M rekommenderar att man i sin validering mäter och registrerar zondiametrar för ca 100 konsekutiva kliniska isolat för vanligt förekommande art-/antibiotikakombinationer. De väljs så att de representerar resistensbestäm-ningssystemet med avseende på inkubations-temperaturer, medier med och utan tillsatser och atmosfär.

8 Staphylococcus aureus - oxacillin 1 µg (B, luft, 30oC)
Staphylococcus aureus - klindamycin 15 µg (A, luft, 37oC) Streptococcus pyogenes - oxacillin 1 µg (B, CO2, 37oC) Streptococcus pyogenes - erytromycin 15 µg (B, CO2, 37oC) Streptococcus pneumoniae - oxacillin 1 µg (B, CO2, 37oC) Streptococcus pneumoniae - erytromycin 15 µg (B, CO2, 37oC) Haemophilus influenzae - ampicillin 10 µg (C, CO2, 37oC) E.coli - trimetoprim 5 µg (A, luft, 37oC) E.coli - nalidixinsyra 30 µg (A, luft, 37oC) E.coli - nitrofurantoin 100 µg (A, luft, 37oC) Pseudomonas aeruginosa - netilmicin 30 µg (A, luft, 37oC) Pseudomonas aeruginosa - imipenem 10 µg (A, luft, 37oC) Pseudomonas aeruginosa - ceftazidim 30 µg (A, luft, 37oC) Campylobacter - erytromycin 15 µg (A, microaerofil, 37oC) Campylobacter - ciprofloxacin 10 µg (A, microaerofil, 37oC)

9 Om laboratoriets zondistributioner avviker från RAF-M:s referenshistogram
Är förutsättningarna lika för referenshistogram och rutinhistogram? Lappstyrka? Tillsatser? Inkubationsmiljö (luft/CO2)? Inkubationstemperatur? Kan dålig överensstämmelse bero på brister/genvägar i art-diagnostik? Är tillräckligt många avläsare inblandade i laboratoriets histogram för att ge representativitet? Den vanligaste orsaken till bristande överensstämmelse är olikheter i inokulat. Dubbelpucklighet i huvudpopulationen förklaras oftast av att endast två personer svarar för histogrammet och att dessa har olika uppfattning om inokulatets täthet eller hur zonen skall läsas.  Drabbar avvikelserna i huvudsak media med tillsats(er) eller media eller lappar känsliga för lagring? Drabbar avvikelserna i huvudsak antibiotika vars aktivitet är pH-beroende (aminoglykosid, erytromycin)? Nitrofurantoin är känsligt för överautoklavering av mediet.

10 Om huvuddelen av histogrammen avviker bör det finnas ett mönster för avvikelserna!
- i huvudsak mindre zoner än referenshistogrammet: insådden för tät, agarvolymen i plattorna för stor, agarbatch-avvikelse. Se metoddelen av RAF-pärmen. i huvudsak större zoner än referenshistogrammet: har någon snålat på agarvolymen vid plattillverkningen? Avviker den aktuella agar-batchen från referensen? Problemlösning: 1. Uteslut ”idiot-orsaker”. 2. Låna snarast 10 plattor från ett annat lab.

11

12 2006

13

14

15

16

17

18 2. Intern QC med referensstammar
Då valideringen utförts och godkänts övergår man till fortlöpande kvalitetskontroll.   Denna kan antingen utföras som (a) daglig (varje vardag) kontroll med referensstammar eller som (b) veckolig kontroll varvid man också måste utföra  kontroller i sb med tillverkningen av resistensplattor. Ju mer sällan kontrollerna utföres desto strängare krav på tillåten avvikelse för det enstaka värdet från rekommenderat intervall.

19 IQC dagligen eller veckoligen
(a) Daglig kontroll med referensstammar utföres genom att referensstammar inkluderas i det dagliga arbetet på laboratoriesektioner (exempelvis S.aureus och E.faecalis på sårsekretavdelningen, S.pyogenes, S.pneumoniae och/eller H.influenzae på luftvägsodlingar, E.coli och P.aeruginosa på urinavdelningen). Den som alltid utför daglig kontroll med referensstammar behöver ej utföra andra kontroller men skall kunna härleda byten av batcher, procedurändringar etc så att avvikelser kan sättas i sb m ändringar i resistensbestämningssystemet. (b) Veckolig kontroll med referensstammar utföres på samma sätt som daglig kontroll men 1 gång i veckan. Om metoden "veckolig kontroll med referensstammar" användes skall den substratkontroll som utföres i sb m tillverkning av resistansmedium kompletteras med kontroll med referensstammar (samma stammar och antibiotika som vid veckokontrollen). I samband med inskolning av ny personal, ny apparatur eller andra större ändringar ersättes veckokontrollen med daglig kontroll.

20 E.coli ATCC 25922 (syn NCTC 12241) Antibiotic MIC (mg/L) Disc (µg)*
Target MIC ranges (internationally agreed in ISO reference)  and zone diameters. Antibiotic MIC (mg/L) Disc (µg)* ISA* (mm) Ampicillin 2-8 10 16-22 Mecillinam 31-37 Pip/tazobactam 1/4 - 4/4 30/6 24-30 Cefadroxil 4-16 30 Cefoxitin Cefpodoxim 0.25-1 Ceftibuten 33-39 Cefuroxime 23-29 Cefotaxime 5 32-38 Ceftazidime Cefepime Aztreonam 30 36-42 Imipenem 10 32-38 Meropenem 35-41 Ertapenem - Amikacin 0,5-4 23-29 Gentamicin 0.25-1 26-32 Tobramycin Nalidixic acid scr) 1-4 27-33 Norfloxacin 33-39 Ciprofloxacin 5 Tetracycline 0.5-2 22-28 Tigecycline Nitrofurantoin 4-16 100 Trimethoprim 29-36 Trim/sulfa <0.5/9.5 1.2/23.8 Colistin *Oxoid Ltd discs and ISA medium

21 Behandla alltid kvalitetskontrollerna som du behandlar rutinbestämningarna på den aktuella laboratorieavdelningen. Använd samma antibiotika och antal lappar per platta, samma inokulat, inkubationstid och läs av kvalitetskontrollerna tillsammans med rutinmässiga resistensbestämningar. Vanligen arbetar ni på dygnsfärska isolat i det kliniska arbetet - referensstammen skall då också vara dygnsfärsk. Enklast och mest utslagsgivande är att under kontrollperioden inkludera QC-stammarna bland de rutinmässigt utförda resistenserna. Registrera resultatet av testerna på ett enkelt och överskådligt sätt och helst så att löpande medelvärden och standarddeviationer kan erhållas. I sin enklaste form kan ett millimeter-papper i A3-format ge utrymme för ett helt år och monteras det på ett bra underlag kan dagens zoner representeras av nålar med färgade huvuden.

22 IQC Slumpmässig avvikelse kan inte undvikas men måste kontrolleras. De av RAF-M rekommenderade stammarna för kvalitetskontroll har i tabellerna givits riktvärden och ett intervall för acceptabel variation. Angivet intervall tillåter en fullt uppnåelig slumpvariation över tid.  Slumpvis förekommande avvikelser utanför intervallet kan godkännas men inte trender eller återkommande mönster. Analysen påverkas av frekvensen av kontrollerna. Om man valt att följa modellen med daglig kontroll accepteras två, men inte tre, på varandra följande avvikelser för ett antibiotikum innan analys/felsökning görs. Om man valt modellen med veckokontroll accepteras inte avvikelser. Redan första avvikelsen skall leda till analys/felsökning. Detsamma gäller kontroller av tillverkningsbatch.

23 Systematisk avvikelse (systematiskt för högt eller för lågt, eller en påvisad trend) skall korrigeras varvid man börjar med att avgöra om den skall tillskrivas resistensmediet  eller en annan del av systemet (inokulat, laboratoriepersonalen, lappstyrka, inkubationstid eller atmosfär). När vanliga tekniska orsaker till systematisk avvikelse uteslutits (batch, volymer, pH, lappstyrka, inkubationsförhållanden mm) är den vanligaste orsaken till systematisk avvikelse för tjockt inokulat.

24 The wild type exhibit little biological variation,
- too little to be clinically utilized - too little to be methodologically reproduced.

25

26

27

28

29