Next Generation Sequencing (NGS) – från forskning till rutindiagnostik Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik.

En presentation över ämnet: "Next Generation Sequencing (NGS) – från forskning till rutindiagnostik Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik."— Presentationens avskrift:

1 Next Generation Sequencing (NGS) – från forskning till rutindiagnostik Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

2 FORSKNINGSPROJEKT MED NGS Doktorandprojekt SYFTE Undersöka de genetiska grunderna till ökningen av Neisseria meningitidis serogrupp Y i Sverige

3 Finetyping 7 x MLST gener porA porB fetA fHbp penA Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro FORSKNINGSPROJEKT MED NGS

4 Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro Journal of Clinical Microbiology July 2015 Volume 53 Number 7 Subtype 1 2006-2012 Subtype 2 1995-2012 Illumina HiSeq, Oxford University 1995-2012 (n=185) Core genome MLST (cgMLST), 1600 gener NGS cgMLST ger er samma grova indelning som ”fintypning” av 12gener YI består egentligen av två subtyper Subtyp 1 är ansvarig för den stora ökningen av McY i sverige

5 Finetyping MLST (7) fHbp fetA penA porB MLVA Epidemiol övervakning – 2 ggr/år Utbrottsutredningar – i stunden Rutintypningar: genetiska/fenotypiska - dagligen/veckovis PCR A B C Y W-135 Kapselgener VR1VR2,3 porA SP GBS MC 16S HI LM DNA prep Serogruppering/antibiogram Identifiering Genogruppering Genosubtypning Misstänkt bakteriell meningit NGS SOM RUTINANALYS? NGS Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

6 MISEQ - ILLUMINA Bibl. prep 2-4 h hands-on 4 - 6 h MiSeq sekv 20 min hands-on 1 - 2 dygn Analys Helt automatiserad på MiSeq eller alt. mjukvara 20 min - 1 dygn Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

7 MISEQ - ILLUMINA Ex. MiSeq körning: MiSeq reagent v3.0 (600 cycle) Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

8 Resuspendera ¼ dels blå ögla av bakterier i 1 ml NaCl Manuell: Wizard® Genomic Purification Kit (Promega) Eluera i Tris-HCL utan EDTA Automatisk: QIASymphony DSP Virus/pathogen MIDI kit med RNAase (Qiagen) Eluera i Tris-HCL utan EDTA Bra kvalité Qubit ® 2.0 Fluorometer (Invitrogen) Späd i två steg ner till 0,2 ng/µL i 10 mM Tris-HCl Qubit – Broad range dsDNA kit Qubit - High Sensitivity dsDNA kit Exakt mängd enl kit: 1 ng Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA DNA extraktion: kvalité + mängd

9 Optimerat flödesschema - NexteraXT DNA preparation (Qubit) Tagmentering PCR-amplifiering PCR-rening Normalisering (kulor) Poolning (Qubit) MiSeq Normalisering (Qubit/TapeStation?) Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro Mät exakt till 0,75 ng 7,5 min Fragmentstorlek / mängd Mängd - mät hela poolen MISEQ - ILLUMINA BIBLIOTEKSPREPARATION

10 Kulbaserad normaliseringqPCR Qubit Normalisering av varje prov MISEQ - ILLUMINA Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

11 DATA ANALYS Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro Databaser för typning av bakterier - Extrahera fintypningsdata: BIGSdb, http://pubmlst.org/software/database/bigsdb/ N. meningitidis mfl Ridom SeqSphere+, http://ridom.com/seqsphere/ MRSA, N. meningitidis mfl Center for Genomic Epidemiology, http://www.genomicepidemiology.org/ ESBL, MRSA mfl (ResFinder, MLST, plasmid MLST, spa mm) 1928 Diagnostics, https://alex.1928diagnostics.com/ (MRSA under utvärdering) QC kontroll: Kvalitetscheck på sekvenserna FastQC (ex. Illumina BaseSpace App) Assembly : Lägga ihop sekvenser ”assembla” till contigs SPAdes (Illumina App), CLC Genomics Workbench, Velvet Optimiser

12 Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro DATA ANALYS Coverage = antal reads x antal cycler totalt / genomstorlek Contig Reads

13 DATA ANALYS Neisseria meningitidis BIGSdb = Bacterial Isolate Genome Sequence Database Neisseria locus/sequence definitions database – Extract finetype from whole genome data Assembled FASTQ file Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

14 DATA ANALYSIS Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MRSA - Ridom SeqSphere+ Samt: Resistensgener PVL TSST ETA/ETB etc SeqSphere templat: AlereMicroarray J. Clin. Microbiol. April 2016 vol. 54 no. 4 1008-1016 1928 Diagnostics (+SCCmec typ)

15 NGS SOM RUTINDIAGNOSTIK PÅ VÅRT LAB 2013-2015 N. meningitidis Epidemiologisk övervakning – 2 / år 2016 N. meningitidis, N. gonorrhoeae, MRSA Rutinmässig genetisk typing / Epidemiologisk övervakning - varje månad 2017/18 N. meningitidis, N. gonorrhoeae, MRSA + C.diff + ESBL Rutinmässig genetisk typing / Epidemiologisk övervakning - varje vecka Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

16 PacBio sekvensering, http://www.pacificbiosciences.com/products/smrt-technology/ inkl Metylering (6mA, 4mC, 5mC) http://www.pacificbiosciences.com/products/smrt-technology/ Bakterie fitness – musstudier inkl Transkriptomanalys (mRNA-NGS) Subtype 1 2006-2012 Subtype 2 1995-2012 …fortsatta projekt nytt doktorandprojekt 12 McY isolat Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

17 SAMMANFATTNING NGS – enorma möjligheter!!! Epidemiologisk typning, utbrottsutredningar, karaktärisera resistensmarkörer, identifiera okända organismer, hitta virulensgener, tumörpaneler, etc Begränsningar Kostar, tar tid, bioinformatiskt kunnande saknas, ger enorma datamängder att hantera MEN Med optimerade biblioteksprepsprotokoll – Jämnare coverage per isolat - fler isolat kan poolas i samma körning – billigare (inga omkörningar) Användarvänliga moln baserade mjukvaror och databaser ex BaseSpace, pubMLST.org – reducerar behovet av bioinformatiskt kunnande för enklare typningsdata för klinisk diagn Automatiserad bibliotekspreparation: minimera hands-on och mer anpassat för rutindiagnostik!!! Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

18 Tack! Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro