Alkoholdehydrogenas – ADH labb 2017-04-06 Alkoholdehydrogenas – ADH labb Biokemi 1 – HT-11 Linda Helmfors liand@ifm.liu.se (linda.helmfors@liu.se) Linköpings universitet

2017-04-06 Dehydrogenaser Enzymer som katalyserar överföring av väte kallas med ett samlingsnamn för dehydrogenaser Alkoholdehydrogenas (ADH) katalyserar oxidation av alkoholer -> aldehyder ADH kräver närvaro av koenzymet NAD+ för aktivitet ADH är ett gruppspecifikt enzym. Snabbast reaktion med etanol men även andra alkoholer fungerar ADH NAD+ Linköpings universitet

Labben Blanda olika alkoholer med ADH och NAD+ Mäta absorbansändringen Beräkna reaktionshastigheten

Reaktionen vi studerar ADH-NAD+ + R-CH2OH ⇌ ADH-NADH + R-CHO + H+

Hur kan vi mäta reaktionshastigheten? Vi kan mäta reaktionshastigheten genom att mäta spektrofotometriskt vid 340nm NADH absorberar ljus till skillnad från NAD+ 1 mol NADH  1 mol alkohol Absorbansökningen per tidsenhet är ett mått på reaktionshastigheten

Reaktionshastighet E mättat på [S] Allt E förekommer som [ES] [E]Tot = [ES] VMax beror av [E] Under dessa beting mäter vi

Absorbans jämfört med reaktionshastighet Överskottet substrat är slut => Reaktionen har nått jämvikt Konstant hastighet Ger oss hastigheten i min-1 men vi vill ha µmol/min

Beräkningar ε ämnesspecifik konstant, här för NADH 6,22 ∙ 103 M-1 cm-1 Lambert-Beers lag: A absorbansenhet ε ämnesspecifik konstant, här för NADH 6,22 ∙ 103 M-1 cm-1 l strålens väg genom kyvetten i cm c koncentration av NADH i kyvetten i M Kan skrivas om:

Beräkningar forts. M/min Detta vill vi göra om till mol/min Skriv sedan i µmol/min i tabellen

Laborationsredogörelse: 2017-04-06 Laborationsredogörelse: Rubrik: Laborationens namn Resultat: Rådata (invägda mängder, spädningar, direkta mätresultat ) tydligt redovisade, gärna i tabellform: Redovisade uträknade resultat baserade på mätdata – Tydligt! Graf över reaktionshastigheten som funktion av enzymmängden Alkohol Mängd ADH Absorbans 1 2 Tid 1 Tid 2 Linköpings universitet

Laborationsredogörelse forts: Ifylld tabell över resultat Resultattolkning/Diskussion: Värdering av resultat och egna slutsatser samt svar på eventuella frågor ställda i laborationshandledningen. Lathund över vanliga returer kommer att sitta uppe på labb Substrat ADH (µl) (mg) ∆A/∆t (min-1) v (µmol/min) v100/vetanol

Kommentarer till returer - ADH Beräkningarna behöver justeras Grafen saknar enheter/fel enhet Uppdatera tabellen och grafen Utvecka diskussionen över resultatet Redovisa beräkningarna med exempel från egna värden Graf saknas Tabell över rådata saknas Diskussion saknas

Förberedelser Läs labbhandledningen innan labben Fundera över: Vilka data behöver vi samla in för att beräkna V? Vad förväntar vi oss för resultat?

Labben i korthet Reaktionen utan enzym: NAD+ + EtOH, blanda -> mät Reaktionen med enzym: NAD+ + EtOH + ADH, blanda snabbt -> mät Upprepa för reproducerbarhet Upprepa (2) med olika volym ADH Upprepa med olika alkoholer

Vi ses på labb!