Polymerase Chain Reaction – PCR Dagens föreläsning: Repetition PCR - Primer design Analys av PCR qRT PCR Polymerase Chain Reaction – PCR Molecular cell biology 7th . Lodish et al. Kapitel 5
Användningsområden för PCR Kopiering av kända DNA fragment från ex. genomiskt DNA Isolering av gensekvenser från organismer och jämföra dem Genterapi
Vad behövs för att sätta upp en PCR reaktion? Templat Primers Nukleotider
Nukleotidens struktur
dATP vs. ATP
DNA Polymeras Buffert Värmekälla
Primerdesign Plats för att rita upp nukleotider och hur de binder till varandra.
Uppgift: Skriv sekvensen på PCR-primers; (hypotetiska 7 nt primers) som ska användas för att amplifiera ett 30 bp DNA fragment från ett dsDNA templat med nedan sekvens. Markera i sekvensen var dina förslag på primrar motsvarar. 5’ GAACCAACGATTACTAGGTAACACATAGATCTGCTACGCTAGCGTTGGACCCTAG 3’ 3’ CTTGGTTGCTAATGATCCATTGTGTATCTAGACGATGCGATCGCAACCTGGGATC 5’ dsDNA 5’ GAACCAACGATTACTAGGTAACACATAGATCTGCTACGCTAGCGTTGGACCCTAG 3’ 3’ CTTGGTTGCTAATGATCCATTGTGTATCTAGACGATGCGATCGCAACCTGGGATC 5’ Uppströmsprimer/5’ Nedströmsprimer/3’
PCR-reaktionens steg Hot start Denaturering Annealing Elongering
Cykler och amplifiering
http://www.youtube.com/watch?v=JRAA4C2OPwg Se figur 5-20 i Lodish
Analys av PCR Agaros EtBr/SYBR safe Stege/Markör Laddningsbuffert Figur 5-19, Lodish
Agarosgel
1µg (10µl) av GeneRuler DNA Ladder Mix innehåller: 120ng av 500 bp fragmentet 120ng av 1000bp fragmentet 32ng av 2000bp fragmentet 120 ng av 3000bp fragmentet.
Spektrofotometri Lambert-Beers lag A=e x l x c
qRT PCR Vidareutveckling av PCR tekniken Mäta mRNA nivåer, genuttryck Mäter PCR produkt efter varje cykel
qRT PCR Reverse transcriptase: SYBR green: House-keeping/referensgen:
http://media.medfarm.uu.se/play/video/2308?module=_sy-qpcr
Polymerase Chain Reaction – PCR Dagens föreläsning: Repetition PCR - Primer design Analys av PCR qRT PCR Polymerase Chain Reaction – PCR Molecular cell biology 7th . Lodish et al. s.191-194