Analytisk Spektroskopi

En presentation över ämnet: "Analytisk Spektroskopi"— Presentationens avskrift:

1 Analytisk Spektroskopi
Analytisk kemi B Student handout URL for this PowerPoint document: User: Student / Password: UmU This compilation © Copyright Knut Irgum, All rights reserved. Because of copyright issues for the figures, this document is intended for internal use in teaching only, and should not be placed on an open Internet server.

2 Ljusets Egenskaper Våg/partikel dualiteten
Ljus kan beskrivas både som vågor och partiklar. När det betraktas som en våg består det av ett snabbt oscillerande elektriskt fält, mot vilket det finns ett vinkelrätt magnetiskt fält. Det elektriska fältet oscillerar i xy-planet Det magnetiska fältet oscillerar i xz-planet Planpolariserat elektromagnetisk strålning med våglängden  som rör sig längs x-axeln.

3 Ljusets Egenskaper Polariserat ljus
Planpolariserat ljus har elektriska och magnetiska fält som ligger i xy- och xz-planen. Opolariserat ljus har vågor fördelade i olika polariseringsriktningar. Förhållande mellan våglängd och frekvens Ljusets hastighet är 2.998·108 m/s Exempel – våglängd för 2.45 GHz strålningen i en mikrovågsugn: [1]

4 Ljusets Frekvens-Energi Samband
Ljus kan även betraktas som partiklar – fotoner En fotons energi är proportionell mot dess frekvens: h är Plancks konstant, 6.626·10–34 J·s–1 Om ekvation 1 och 2 kombineras, kan man få fram sambandet mellan energi och ljusets våglängd där n är vågnumret, dvs 1/ Energin är omvändt proportionell mot våglängden och direkt proportionell mot vågtalet Rött ljus har längre våglängd är blått ljus och därför lägre energi Vågtal är vanligast i vibrationsspektroskopi, där de uttrycks som cm-1 [2] [3]

5 Det Elektromagnetiska Spektrumet
Det elektromagnetiska spektrumet med exempel på några molekylära processer som äger rum när strålning absorberas inom varje region. Synligt ljus omfattar våglängdsområdet mellan 380 och 780 nm.

6 Absorption av Fotoner Absorption = upptag av energi
Atomers och molekylers energi ökar när de absorberar fotoner. Atomen eller molekylen övergår då oftast från grundtillståndet till det exciterade tillståndet. Vid återgång återemitteras energin. Exempel: Uppvärmning av mat i mikrovågsugn

7 Instrumentering för mätning av ljusabsorption
Spektrofotometrar Mäter skillnaden i ljus mellan infallande strålning och strålning som passerat genom ett prov, dvs transmissionen av ljus. Mätningen sker oftast med monokromatiskt ljus, dvs strålning av endast en våglängd (i realiteten en liten del av det spektrum). Ljuset från ljuskällan passerar en monokromator, dvs ett element som väljer ut en smal del av det elektromagnetiska spektrumet. Ljus med infallande strålningseffekt P0 absorberas av provet, så att dess intensitet efter passagen minskar till strålningseffekten P. Schematisk bild av en enkelstrålespektrofotometer.

8 Transmittans och Absorbans
Transmittans - Andelen ljus som passerar genom provet Varierar mellan 0 % (allt absorberat) till 100 % (ingen absorption). Absorbans – Beer’s Lag Ger ett analytiskt användbart linjärt samband mellan halt och absorbans: Absorbansen A är en dimensionslös enhet: där c är koncentrationen uttryckt i mol/liter, dvs M , b är absorptionscellens längd, oftast uttryckt i cm och  är molära absorptiviteten (ofta kallad extinktionskoefficienten) Uttrycker hur mycket som absorberas per koncentrationsenhet och cell-längd vid en viss våglängd och har därför enheten M–1cm–1 [4] [5] [6]

9 Visualisering av Absorbans

10 Absorptionsspektra och Färg
Absorption och reflektion ger föremål färg Källa:

11 Absorptionsspektrum för en solskyddskräm i UV-A och UV-B.
Absorptionsspektra Visar hur A eller  varierar med  Absorptionsspektrum för en solskyddskräm i UV-A och UV-B.

12 Spektrofotometri i Praktiken
De olika komponenterna i en spektrofotometer Ljuskällan skall ge så mycket ljus som möjlig vid aktuell mätvåglängd Monokromatorn bör låta enbart en smal del av spektrum passera Kompromiss mellan bandbredd och ljusintensitet Kyvetten I ett enkelstråleinstrument måste P0 mätas separat innan P med enbart lösningsmedel i kyvetten

13 Spektrofotometri i Praktiken
Kyvetten – Materialval och hantering Materialvalet är kritiskt, särskilt i UV Kyvetter med olika mätdjup finns för olika mätändamål Täckta kyvetter hindrar avdunstning Matchade kyvetter bör användas Rengöring av kyvetter är väsentligt Undvik fingeravtryck och repor Vänd alltid kyvetten åt samma håll Mät helst inom 0.4 < A < 0.9

14 Att dra nytta av Beer’s Lag
Var kritisk i valet av våglängd Välj en våglängd där skillnaden mellan nyttosignal och bakgrund är så stor som möjligt I regel är den längsta praktiskt möjliga våglängden den som ger minst störningar från andra komponenter än analyten Proteiner mäts t ex ofta vid 280 nm

15 Kromogena Reaktioner Omvandling av ofärgade föreningar till absorberande Bildning av en kraftigt färgad diazoförening genom reaktion av nitritjoner med sulfanilamid och N-(1-naftyl)etylendiammoniumjoner i sur lösning. Kan ofta användas för att möjliggöra mätning av föreningar som saknar färg Selektiva förgbildningsreaktioner är mycket användbara för kemisk analys Praktiskt att kunna skifta väglängden till en “tyst” del av spektrum Kromogena reaktioner innebär ofta mer arbete och ibland otrevliga kemikalier Sidoreaktioner och andra störningar är tyvärr inte ovanliga Den färgade föreningen är ofta instabil och mätning måste ske ”på tid”

16 Kalibrering i Spektrofotometri
Standardkurvan I kvantitativ analys användar man ofta en kalibreringskurva. Standards med känd halt mäts i en lösning som liknar provmatrisen så mycket som möjligt. Absorbansen för dessa standards avsätts som en funktion av halt. Provhalterna skall justeras så att de faller inom kalibratingskurvan Reagensblank En “blank” tillreds av analytfritt artificiellt prov. Absorbansen bestäms med exakt samma procedur som för proverna. Absorbansvärdet för reagensblanken dras från provernas absorbans. På så sätt korrigeras för föroreningar reagens och lösningsmedel.

17 Spektrofotometern Dubbelstrålespektrofotometern Scannande monokromator
Delar upp polykromatiskt ljus i sina våglängdskomponenter Ett litet våglängdsområde väljs ut och får passera genom provet Monokromatorn kan oftast scannas, dvs våglängden kan varieras

18 Spektrofotometern Choppern – “hjärtat” i ett dubbelstråleinstrument
“Choppern” länkar alternerande om ljuset genom kyvetterna med prov respektive referenslösning flera gånger per sekund Utjämnar fluktuation och drift i lampintensitet och detektorrespons Den bildade kvoten mellan P0 och P blir därigenom mer pålitlig Mekaniskt mer komplicerad och kräver med avancerad elektronik Fler spegelytor och andra optiska element som “stjäl” ljus Mätning av provet sker mindre än halva totala mättiden

19 Spektrofotometern

20 Spektrofotometerns Ljuskälla
Val av korrekt ljuskälla Skall alstra ett starkt polykromatiskt ljus inom rätt våglängsområde

21 Spektrofotometerns Ljuskälla
Wolframlampan (“The Tungsten Lamp”) Inom synliga våglängdsområdet används i regel en halogenlampa med glödtråd av wolfram som ger en “färgtemperatur” på 3000 K. Wolframlampan genererar ljus nära perfekt “black body radiation” inom intervallet nm med max kring nm. Används för spektrofotometri inom synliga området och nära IR. Deuteriumlampan Urladdningslampa fylld med deuteriumgas (D2) under lågt tryck. Emitterar ljus kontinuerligt inom våglängdsområdet nm. Används vid UV-spektrofotometri. Kvicksilverlampor och Xenonlampor Används pga av linjeemission i huvudsak för fluorescensmätningar

22 Monokromatorn Spektrofotometerns våglängdsdispersiva komponent
Selekterar vald våglängdsområde baserat på interferensprincipen In- och utgångsspalterna Smalare spalt ger minskad band-bredd men också minskat ljusflöde Två konkava speglar “Kollimerar” ljuset, dvs expanderar inkommande strålar till parallellt ljus och återfokuserar utfallande ljus från gittret på utgångsspalten Diffraktionsgitteret Delar upp det kollimerade ljuset i de olika ingående våglängderna

23 Diffraktionsgittrets Funktion
Principen för diffraktion Gittret är glasplatta (i regel platt) med ett stort antal parallella linjer (ritsar) ingraverade eller replikerade från ett “mastergitter” När ljus reflekteras från eller transmitteras genom gittret beter sig varje linje som en separat “ljuskälla” Infallande ljus av olika våglängder går olika vägar genom gittret eller reflekteras i olika riktningar från gittrets yta

24 Diffraktionsgittrets Funktion
Interferens Intilliggande vågor i fas förstärker varann, medan vågor helt ute ur fas släcker ut varann.

25 Diffraktionsgittrets Funktion
Konstruktiv interferens Uppstår när skillnaden i väg som två vågor måste gå är en multipel av l [7] Integern n är “diffraktionsordningen” och kan ha värdena ±1, ±2, … Maximal intensitet uppnås vid “första ordningen”, dvs n = ±1 Från figuren ses att a = s sin q och b = d sin f. För-utsättningen för konstruktiv interferens är därför: [8] I regel överlappas första ordningens diffraktion av högre ordningars diffraktion av kortare våglängder (1/ordningen). Filter måste kopplas in och ur vid scanning över 2 ggr lägsta våglängden. Bra instrument har ofta flera gitter eller seriekopplade monokromatorer.

26 Spaltbreddens Inverkan
Bandbreddskompromissen Minskad spalt ger minskad bandbredd, men minskar även ljusmängden som kan passera genom monokromatorn. Upplösning av skarpa absorptionsband kräver smal bandbredd och kan endast uppnås till priset av minskat S/N ratio. För kvantitativ analys brukar en band-bredd på 1/5 av absorptionsbandets bredd vara acceptabelt.

27 Spektrofotometerens Detektor
Omvandling från fotoner till elektrisk ström Detektorn skall producera elektrisk ström när den träffas av ljus. Ofta har detektorerna ett påtagligt våglängdsberoende. Får inte bidra till att försämra mätningarna genom brus eller drift. I ett enkelstråleinstrument måste P0 mätas varje gång våglängden ändras eftersom detektorsignalen är beroende av våglängden.

28 Spektrofotometerens Detektor
Fotomultiplikatorn Primära elektroner emitteras från en fotokänslig glaskatod på rörets yta Dessa elektroner accelereras mot en sekundär elektrodyta (dynoden) På vägen till dynoden har kinetiska energi ökat hos elektronerna När elektronen träffar dynoden rivs därför flera nya elektroner loss Dessa accelereras mot nästa dynod och processen upprepas flera gånger

29 Diodarray-Spektrofotometrar
Insamling av hela spektra utan fysisk scanning I en diodarray-spektrofotometer är fotomultiplikatorn ersatt med en fotodiodarray som kan samla in och mäta ljus i hela fokalplanet. Detta leder till en starkt förenklad instrumentkonfiguration. Innehåller upp till 1024 dioder med mått liknande en normal spalt. Diod-arrayerna är känsliga inom i stort sett hela UV-Vis området.

30 Diodarray-spektrofotometrar
Simultan datainsamling Data från i stort sett hela spektrum kan samlas in på bråkdelen av en sekund med upprepning flera gånger i sekunden. Slutaren kan frysa spektrum helt simultant för sekventiell utläsning. Mycket användbar för studier av dynamiska förlopp som t ex vid detektion i HPLC. Typisk upplösning (bandbredd) 1-3 nm. Inga rörliga delar Diodarray-spektrofotometern bygger på en polykromator. Detta innebär att provet belyses med polykromatiskt ljus. Fluorescens kan orsaka problem. Den lägre känsligheten kompenseras av kontinuerlig mätning.

31 Analys av Blandningar Absorbans är additiv
När det finns mer än en absorberande förening är A vid en våglängd summan av absorbanserna för varje förening: [9] Om man mäter absorbansen för de enskilda komponenterna kan man summera dessa och få deras bland-spektrum. Motsvarande, om vi känner spektra för de enskilda komponenterna, kan man dekonvulera ett summa-spektrum i enskilda beståndsdelar. Spektra i synligt av väteperodidkomplex av 1.32 mM Ti4+ och 1.89 mM V5+, samt en lösning innehållande båda jonerna i okänd koncentration.

32 Analys av Blandningar Bestämning av komponenter med linjärkombination
Våglängderna väljs i regel vid varje komponents absorbansmaximum. Vi kan då uttrycka absorbansen vid l’ och l’’ enligt Beer’s lag: [10] Om vi löser dessa ekvationer för X och Y, finner vi att: [11] där [12]

33 Isosbestiska Punkter Användbart vid studier av kemiska reaktioner
Om en förening omsätts till en annan i en kemisk reaktion uppstår en karaktäristisk serie av spektra. Om spektra för de två föreningarna har punkter som korsar varann (vid lika koncentration) kommer att särskilt beteende att uppvisas. Skärningspunkten (isosbestiska punkten) kommer att ligga kvar på samma absorbans, medan resten av deras spektra ändras:

34 Vad händer när en molekyl absorberar ljus?
Exciterade tillståndet När en molekyl absorberar ljus överförs den till det mer energirika exciterade tillståndet Likaså, när en molekyl emitterar en foton minskar dess energi motsvarande den emitterade fotonens energi Elektroniska tillstånd för formaldehyd

35 Vad händer när en molekyl absorberar ljus?
Molekylorbitaler Beskriver fördelningen av elektroner i molekyler, på samma sätt som atomorbitalerna beskriver elektronfördelningen kring fria atomer I formaldehyd är fyra låga orbitaler s1 till s4 vart och ett ockuperat av ett elektronpar med motsatt spinn På högre energinivå finns ett p-orbital, som bildats av py orbitalerna hos kolet och syret. Det ockuperade orbital som har högst energi är det icke-bindande orbitalet (n) som bildas av de två elektronerna i syrets 2px orbital. Det icke-ockuperade orbitalet som har lägst energi är det anti-bindande p-orbitalet (p*), där en elektron orsakar repulsion snarare än attraktion mellan kol- och syreatomerna.

36 Vad händer när en molekyl absorberar ljus?
Elektronisk transition En elektron flyttar från ett orbital till ett annat Transitionen som kräver lägst energi är överföringen av en elektron från icke-bindande orbitalet (n) till anti-bindande p-orbitalet (p*). Det finns nu två möjligheter, beroende på spinkvanttalen i det exciterade tillståndet: Vid motsatta spinn har vi ett singlett-tillstånd Vid parallella spinn har vi ett triplett-tillstånd De lägsta singlet- resp triplett-tillstånden benämns S1 och T1. I allmänhet har T1 lägre energi än S1. För formaldehyd kräver transitionen n ž p*(T1) synligt ljus (397 nm) medan transitionen n ž p *(S1) kräver UV-strålning vid 355 nm.

37 Vad händer när en molekyl absorberar ljus?
Vibrations- och rotationstillstånd för formaldehyd IR- och mikrovågsstrålning är inte energirik nog för att excitera elektronisk transition, men de kan påverka vibrations- och rotationsrörelser hos molekyler. Sex olika typer av vibrationstranslationer är kända för formaldehyd. Energin som ger upphov till elektronisk excitation är i regel energirik nog att åstadkomma övergångar i vibrations- och rotationstillstånden hos en molekyl. Elektroniska excitationsband är därför i regel breda på grund av att de är överlagrade med vibrations- och rotationsövergångar.

38 Relaxationsprocesser
Snabb vibrationsrelaxation För en molekyl som exciteras till ett högre elektroniskt tillstånd är den första relaxationsprocessen i regel en återgång till den lägsta vibrationsnivån i det exciterade tillståndet (övergång R1), varvid energin förloras genom kollision med andra molekyler. Intern omvandling Från S1 kan molekylen övergå till en högre vibrationsnivå i S0 genom en process som kallas intern omvandling (IC). Därifrån kan molekylen snabbt relaxera tillbaks till grundtillståndet genom ytterligare kollision med lösningsmedel och andra molekyler. Om molekyler följer vägen A-R1-IC-R2 förloras all energi som värme.

39 Relaxationsprocesser
“Intersystem crossing” Molekylen övergår från singlett till triplett exciterat tillstånd. Eftersom triplett-tillståndet har en lägre energi än singlet-tillståndet kan en återgång inte ske utan ett tillskott av energi. Återgången till grundtillståndet är en “förbjuden övergång”. Kan leda till fördröjd emission av en foton, dvs fosforescens. Fluorescens Om molekylen inte kan relaxera tillbaks till grundtillståndet via en gynnad vibrationsrelaxation eller genomgår “intersystem crossing” kan övergång från S1 till S0 ske via emission av en foton, vilket leder till fluorescens.

40 Fluorescens och Fosforescens
Båda processerna är relativt sällsynta Tävlande relaxationsprocesser som orsakas av kollisioner och interna energiomvandlingsprocesser är i regel mycket snabbare. Fluorescens emitteras mellan 0.01 och 10 µs efter excitation. Livstiden hos en exciterad molekyl i triplett-tillståndet kan vara från 10 µs, ändå upp till 100 s. Fosforescens är därför ännu mer sällsynt än fluorescens.

41 Fluorescens och Fosforescens
Våglängdsskift och “spegling” i fluorescens Fluorescens emitteras vid en våglängd som är längre än excitationsfotonens. Våglängdsskiftet kallas “Stoke’s skift”. I fluorescensspektra finns även toppar som inte är fluoresens, utan Raman-signaler, vars upphov är icke-elastisk ljusspridning, relaterat till molekylens vibrationsspektrum. Fluorescensspektrum är oftast en spegelbild av absorbansspektrum. Förklaringen till att spektra speglas ligger i fördelningen av vibrationsnivåerna i grund-tillståndet och det exciterade tillståndet, som är i grova drag lika.

42 Instrumentering för fluorescens
Fotoluminescens kräver dubbla monokromatorer En monokromator krävs för att välja excitationsvåglängden En monokromator krävs för att ta upp emissionsspektrum Linjärt kalibreringssamband Sambandet mellan provkoncentrationen och fluorescensintensiteten är i princip linjärt. Vid absorbanser över 0.05 A avviker signalen negativt pga ”inner filtering”. Vid höga koncentrationer kan ”quenching” uppstå pga ”external conversion”.

43 Applikation ev fluorescens
Enzyme-linked Immunoassay – ELIZA

44 En praktisk tillämpning
En fluorescent fiberoptisk biosensor En biosensor baserad på beläggning av en optisk fiber med antikroppar kopplad med mätning av den fluorescens som uppstår i det evanescenta fältet och länkas åter i fibern när exciterande ljus som skickas ut i fibern exciterar sekundära fluorescenta antikroppar som bundit till antigenet. I diagrammet till höger visas kalibreringskurvan dör biosensorn.