Sampling of diatoms as bioindicators Påväxtprovtagning för kiselalgsanalys Maria Kahlert & Amelie Jarlman (SLU) (Jarlman HB, Lund) Swedish University of Agricultural Sciences Dep. of Environmental Assessment www.ma.slu.se

Sampling of diatoms as bioindicators General Diatoms are used for biomonitoring of water quality in most countries in Europe, and also in USA, Australia, Japan and Brazil. For Europe, the diatom method is recommended for monitoring of almost all stream types (Hering et al. 2006). The method is based upon the fact that all diatoms have different optima and tolerance limits for different environmental variables (nutrients, organic pollution, acidity). Kiselalger används allmänt för att bedöma vattenkvalitet i Europa, liksom i många andra länder såsom USA, Australien, Japan och Brasilien. I Hering et al. (2006) rekommenderas kiselalger som bioindikator i de flesta typer av europeiska vattendrag. Metoden baseras på det faktum att alla kiselalger har optima med avseende på tolerans eller preferens för olika miljöförhållanden (näringsrikedom, organisk förorening, surhet mm.). Vid regelbundna europeiska möten (”Use of Algae for Monitoring Rivers” Düsseldorf 1991, Innsbruck 1995, Douai 1997, Durham 2000, Krakow 2003, Balatonfüred 2006 och kommande möte i Luxemburg 2009) diskuteras och harmoniseras provtagnings-, analys- och utvärderingsmetoder (jfr Kelly et al. 1998; SIS 2003; SIS 2005).

Sampling of diatoms as bioindicators General Diatoms are found almost everywhere, and their taxonomy and ecology is well documented. In some waters it is the only feasible biological method (Dell'Uomo 1996). Diatoms often reflect water quality better than other organisms (Prygiel och Coste 1996, Hering et al. 2006). Kiselalger finns nästan överallt och deras taxonomi och autekologi är väl dokumenterad. Ibland den enda genomförbara biologiska undersökningen (Dell'Uomo 1996). Ofta speglar kiselalger vattenkvaliteten bättre än andra organismer (Prygiel och Coste 1996, Hering et al. 2006).

How to sample diatoms as bioindicators? Hur tar man prover för kiselalgsanalys? Following: SIS (2003). SS-EN 13946. Water quality – Guidance standard for the routine sampling and pretreatment of benthic diatoms from rivers (Vattenundersökningar - Vägledning för provtagning och förbehandling av bentiska kiselalger i vattendrag)

Why this course? 10 % of the differences between diatom samples can be explained by the sampling (Prygiel et al. 2002). Experienced samplers have less errors. Varför denna kurs? Skillnader mellan prover kan till 10 % förklaras med provtagningen (Prygiel et al. 2002). Rutinerade provtagare gör färre fel. But, different protocols do not give SO much different results, e.g. EMAP and STAR sampling protocols, in general, collect similar diatom assemblages. However, researchers should exercise caution when combining diatom data sets collected with different sampling protocols, particularly in large streams, where the potential for sampling of multiple habitats is increased weilhofer & Pan 2007.

Do not sample in deep shadow.* Undvik kraftigt skuggade lokaler.* Sampling must be done in the main stream channel. Avoid very strong or very slow flow. Prov tas i huvudfåran och områden med väldigt starkt eller långsamt flöde undviks. Sampling is done in the euphotic zone (‘as deep as your arms’). Prov tas i den eufotiska zonen där dina armar når ner till stenarna. The substrate must have been under water at least 4-6 weeks before sampling. Substratet måste ha varit täckt av vatten 4-6 veckor före provtagning. Do not sample in deep shadow.* Undvik kraftigt skuggade lokaler.* Undvik områden med väldigt starkt flöde av säkerhetskäl. Undvik även områden med väldigt långsamt flöde (< 0.1 m s-1), där kan planktiska alger och detritus ackumuleras. Om man kan se substratet är det i den eufota zonen Om man kan vada i vattnet är det inte för djupt. * Det är naturligtvis OK att ta prover iI skuggan om hela ån är skuggat. picturesKelly & Yallop

Sampling site In case of repeated sampling, use the same marked sampling site. Document by x/y coordinates, fixed points at the shoreline, a drawing (and a photograph). Vid återkommande provtagningar används fasta provtagningssträckor. Läget anges med x/y-koordinater, samt relateras till fixpunkter på land och dokumenteras med skiss och ev. foto. Use a field protocol. Använd fältprotokoll.

Sampling is done along a 10 m long ’river segment’, which is as representative for the stream as possible regarding substrate, vegetation, depth, velocity, and light. Prov tas från en ca 10 m lång provtagningssträcka, som är representativ för lokalen när det gäller bottensubstrat, vegetation, vattendjup, vattenhastighet och ljus. 10 m

Sampling should, if possible, be carried out across the whole river, otherwise as long out as possible. Provtagningssträckan omfattar helst hela vattendragets bredd; annars så långt ut i vattendraget som är möjligt, beroende på djup- och strömförhållanden.

Do not sample areas close to the bank. Området närmast strandkanten undviks dock.

Diatoms can be found on many substrates, but if possible, sample STONES Kiselalger växer på många substrat, men ta prover helst från STEN stones with filamentous algae stenar med trådformiga alger artificial substrate konstgjorda ytor stones and boulders stenar och block Kiselalger på sediment återspeglar inte så mycket vattnets kvalitet som nedbrytningen av sedimentets organiska ämnen (Hodgkiss & Tai 1976; Cox 1990; Vadeboncoeur et al. 2001). Substratet trä kan hysa väldigt olika algsamhällen (Hodgkiss & Tai 1976; Vadeboncoeur et al. 2001, Jarlman personligt meddelande) och är för lite undersökt för att kunna användas. sand & fine sediment sand & finsediment macrophytes vattenväxter from Kelly & Yallop

Collecting the diatoms Stones Submerged for at least 4-6 weeks before sampling Not covered by filamentous algae or mosses ~ 10-25 cm Ø (’cobbles’) at least 5 stones Oligotrophic / small stones: at least 10 stones Stenarna under vatten i minst fyra veckor före provtagningen utan trådformiga alger/mossa ~ 10-25 cm i diameter minst 5 stenar näringsfattigt / små stenar: minst 10 stenar Use cobbles, as they are relatively simple to handle but do not move under normal stream velocity. If not present, use pebbles or boulders instead. If all stones are covered by filamentous algae, use macrophyte substrates instead. This is actually against the EU standard! It says you should use stones coeverd by algae, when whole streams is covered > 75 %. When using those stones, the algae should be removed first and the diatoms growing under should be used. But ligth limitation ???

Filter the stream water if turbid Hold stone above tray Fill a jar with a certain volume of clean stream water (200-500 ml depending on sample bottle size) Filter the stream water if turbid Hold stone above tray Brush upper surface of stones vigorously with a new/clean toothbrush to remove the diatoms Use little of the stream water to rinse the diatoms from toothbrush and stones into the tray Brush and rinse at least 3 times per stone Water in tray should be brown and turbid Stream water can be filtered through a plankton net, 10 µm holes if possible. Make sure you clean the net in between!. If stream water is clean, it can be used as it is. Better: Hold stone above tray ! Pictures from Kelly & Yallop

Filtrerar vatten om den är grumligt Håll stenen över vannan. Tag 200-500 ml rent å-vatten i ett litermått (beroende på provtagningsburkarnas storlek). Filtrerar vatten om den är grumligt Håll stenen över vannan. Borsta den övre ytan och skölj ner materialet i vannan med små mängder av vattnet. Borstningen och sköljningen upprepas åtminstone 3 gånger på varje sten. Vattnet i vannan ska vara tydligt grumligt till slut. Stream water can be filtered through a plankton net, 10 µm holes if possible. Make sure you clean the net in between!. If stream water is clean, it can be used as it is. OBS: Håll stenen över vannan! Foton: Kelly och Yallop

Homogenize sample and transfer the water from tray into labelled sample bottles: Two 100-250 ml bottles + one 20 ml bottle (1 sample for analysis, 1 spare sample, 1 small one for analysis of living algae) Note volume of used stream water and number of scraped stones in field protocol Materialet blandas noggrant och hälls i två 100-250 ml burkar. För analys av levande material fylls även en liten burk på ca 20 ml. Hur många stenar som borstats samt hur mycket vatten som använts ska anges på fältprotokollet. 100-250 ml 20 ml optionally

Allow the large bottles to stand until material has settled on the bottom of the jar. Pour off 2/3 of the clean supernatant and replace with 96% ethanol. Send one bottle to diatom expert. Store the other bottle until the analysis is finished. Keep the small bottle cool and dark and send it to the expert as soon as possible after sampling. Låt stora burkarna stå tills materialet sjunkit ordentligt och dekantera därefter av ca 2/3 av vätskan och ersätt med 96% sprit. Ena burken skickas till kiselalgsexperten och den andra sparas Lilla burken förvaras mörkt och svalt och skickas ofixerad, senast dagen efter provtagningen, till experten. analysis spare ethanol x Denaturerad sprit går bra, om det inte ska förvaras länge. Rödsprit går ej, den konserverar inte bra nog. För längre förvaring ersätt denaturerad sprit med odenaturerad. Lugols fungerar också, men inte i längden för då löses små tunna algskal upp. living material optionally

Men ibland kan vattendragen ser ut så här Storån, Södermanland

alternatives substrates SE recommendation: submerged macrophytes (NOT too old or too young plants!) other: vertical man-made surfaces in situ introduced (’artificial’) substrates (tiles, rope, not glass) macroalgae emergent macrophytes (stems) SE rekommenderar: submersa makrofyter (OBS ej för gamla eller unga växter!) andra: vertikala konstgjorda ytor in situ såsom betong, flytblock introducerade konstgjorda ytor (kakel, rep, ej glas) makroalger övervattensväxter (stjälkar) Too old plants: maybe stuff diffusing out, Nitzschia, Navicula, heterotrophs. Too young: Early succession, mostly AMIN. Artificial substrates: do rather not use glass (not recommended by EU standard) but rough tiles or frayed polypropylene rope Emergent macrophytes: do rather not use them, if using, then use the submerged stem by cutting up and down

hard substrate: as stones Sampling: hard substrate: as stones macrophytes/rope: sample/cut at least 5 replicates and place in sample bottle with clean stream water, shake vigorously and remove substrate Provtagning: hårda substrat: som stenar makrofyter/rep: plockas/klipps av och läggs i burken med å-vatten. Burken skakas kraftigt, varefter materialet kramas ur och avlägsnas Too old plants: maybe stuff diffusing out, Nitzschia, Navicula, heterotrophs. Too young: Early succession, mostly AMIN. Artificial substrates: do rather not use glass (not recommended by EU standard) but rough tiles or frayed polypropylene rope Emergent macrophytes: do rather not use them, if using, then use the submerged stem by cutting up and down

Macroalgae/bacteria In case of ≥ 50% cover of macroalgae or presence of macroscopic bacteria cover (greyish-white bushy filaments): take a sample, store cool and dark with a little stream water, and send to algal expert for analysis note degree of cover in field protocol Om det finns ≥ 50% täckning av makroalger på provtagningslokalen eller makroskopiskt bakteriepåväxt (gråvita/beiga tofsar), även i mindre mängd ta ett prov, förvara det mörkt och svalt med lite å-vatten, och skicka till experten täckningsgraden anges på fältprotokollet

Sampling time/tiden för provtagningen SE recommendation: Long term monitoring: autumn sampling before macrovegetations decay Frequency: yearly sampling Other aims: sampling is possible during the whole year The diatom community is adapted to changes in water quality during the whole year. (Iserentant and Blancke 1996; Rimet et al. 2005; Kahlert & Andrén 2005). However, sudden changes will be reflected already after some day. (Lowe & Pan 1996, Eloranta 1999; Hirst et al. 2004). SE rekommenderar Tidsserieövervakning: provtagning under hösten innan nedbrytningen av makrovegetationen Frekvens: ett prov per år andra ändamål: prov kan tas i princip året om Kiselalgssamhället återspeglar förhållandena i vattendraget under en längre period, upp till ett år före provtagningen. Samtidigt reagerar organismerna så pass snabbt på förändringar att t.ex. punktutsläpp kan spåras redan efter någon dag. påväxtsamhället är maximalt utvecklat, dvs. på sensommaren/hösten innan nedbrytningen av makrovegetationen börjar Kiselalgssamhället i ett vattendrag verkar vara anpassat till vattendragets ekologi, med dess naturliga variation, och därför representerar ett prov inte bara perioden direkt före provtagningen, utan hela året. En förändring av vattenkvaliteten utanför den naturliga variationen kommer också att synas (Lowe & Pan 1996).

LAKES/SJÖAR Littoral diatoms as bioindicators: Tested successfully in several European countries: UK, Austria, Hungary, Spain One site per lake, if it is chosen with care, is sufficient to reflect the water quality of the lake (King et al. 2005). Advantage above sediment diatoms: simple sampling and finer temporal tuning (King et al. 2000). Kiselalger från littoralen som bioindikatorer: Framgångsrikt testat i flera EU länder: UK, Österrike, Ungern, Spanien En enda noga vald lokal återspeglar vattenkemin för hela sjön (King et al. 2005). Fördelen gentemot kiselalger från sediment: enklare provtagning och bättre tidsmässig upplösning (King et al. 2000). But we have not had time to check it for SE yet.

Operational monitoring Lessons from UK UK recommendation for operational monitoring of nutrient reduction in streams (e.g. by water treatment plants) (Kelly 2003): Use of at least 4 sampling sites per discharge Repeated sampling (at least six samples to ensure statistical power) UK rekommendation för operativa övervakningen av närsaltsreducering i vattendrag (t.ex. genom reningsverk) (Kelly 2003): Minst 4 provtagningslokaler per ‘utsläpp’ Upprepade provtagningar (minst 6 provtagningar för en säker statistik)

Operational monitoring Sampling stations monitoring a point source reference site 2: impacted by town Impacted site 1: by organic pollution (and by town) reference site 1: not impacted Impacted site 2: only (?) by nutrients Question: Does the STW work well and strip nutrients from stream? It is not enough only to use one site directly after the STW to see if it works. You need a reference site, but the one upstream the town is probably not the same than downstream. Furthermore: The organic pollution will probably be gone later in stream, the aim is the site 2. Fig 1. Schematic representation of sampling strategy. = sampling stations (from Kelly 2003).

Operational monitoring Temporal and other variation Simultaneous upstream and downstream sampling eliminates temporal variation and permits the use of a paired sample t-test. However, repeated sampling is necessary to ensure that any trends observed by ecological monitoring are robust (e.g. both broad trends and changes at point sources). As a general rule at least six samples are required to ensure that results have a statistical power > 0.8. Samtidiga provtagningar uppströms och nedströms en punktkälla eliminerar tidsvariationen och gör en t-test möjligt. Men provtagningen måste upprepas åtminstone 6 gånger för att säkerställa en statistisk power > 0.8. Light limitation, temporal succession, but also time lag before a diatom community reacts on nutrient stripping, if P is in total excess.

References Ács, É., Reskóné, N. M., Szabó, K., Taba, Gy. & Kiss, K. T. (2005). Application of benthic diatoms in water quality monitoring of lake Velence – recommendations and assignments. Acta Bot. Hung. 47 (3-4):211-223. Blanco, S., Ector, L. & Bécares, E. (2004). Epiphytic diatoms as water quality indicators in spanish shallow lakes. Vie Milieau, 54 (2-3):71-79. Epiphytic, littoral diatoms as bioindicators of shallow lake Dell'Uomo, A. (1996). Assessment of water quality of an Apennine river as a pilot study for diatom-based monitoring of Italian watercourses. Use of algae for monitoring rivers II. B. A. Whitton and E. Rott. Innsbruck, Institut für Botanik, Univ. Innsbruck: 65-72. Hering, D., Johnson, R. K. & Buffagni, A. (2006). Linking organism groups – major results and conclusions from the STAR project. Hydrobiologia 566:109-113. Hirst, H., Chaud, F., Delabrie, C., Juttner, I. & Ormerod, S. J. (2004). Assessing the short-term response of stream diatoms to acidity using inter-basin transplantations and chemical diffusing substrates. Freshw. Biol. 49: 1072-1088. Iserentant, R. & Blancke, D. (1996). A transplantation experiment in running water to measure the response rate of diatoms to changes in water quality. In: Ricard, M. (ed), Proceedings of the 8th Diatom symposium, Koeltz Scientifc Books, Königstein, pp. 347-354. Kahlert, M. & Andrén, C. M. (2005). Benthic diatoms as valuable indicators of acidity. Verh. Internat. Verein. Limnol. 29: 635-639. Lowe, R. L. & Pan, Y. (1996). Benthic algal communities as biological monitors. Algal Ecology: Freshwater Benthic Ecosystems. R. J. Stevenson, M. L. Bothwell and R. L. Lowe. San Diego, Academic Press: 705-740. M.G Kelly and M. Yallop. DARES-consortium. Sampling diatoms from running waters (ppt). http://craticula.ncl.ac.uk/dares/ M.G Kelly (2003): Use of diatoms to monitor eutrophication in UK rivers. http://mysite.wanadoo-members.co.uk/bowcon/TDI_in_practice.doc King, L. Barker, P. & Jones, R. I. (2000): Epilithic algal communities and their relationship to environmental variables in lakes of the English Lake District. Freshwater Biology Applied Issues (2000) 45, 425–442. King, L., Clarke, G., Bennion, H., Kelly, M. & Yallop, M. (2005): Sampling littoral diatoms in lakes for ecological status assessments: a literature review. Environment Agency. Science Report SC030103/SR1. Políčková, A., Duchoslav, M. & Dokulil, M. (2004). Littoral diatom assemblages as bioindicators of lake trophic status: A case study from perialpine lakes in Austria. Eur. J. Phycol. 39:1-10. Prygiel, J., Carpentier, P., Almeida, S., et al. (2002). Determination of the biological diatom index (IBD NF T 90–354): results of an intercomparison exercise. J. Appl. Phycol. 14: 27-39.SIS (2003). Rimet, F., Cauchie, H. M., Hoffmann, L., et al. (2005). Response of diatom indices to simulated water quality improvements in a river. J. Appl. Phycol. 17: 119–128. SS-EN 13946. Water quality - Guidance standard for the routine sampling and pretreatment of benthic diatoms from rivers (= Vattenundersökningar - Vägledning för provtagning och förbehandling av bentiska kiselalger i vattendrag). C. L. Weilhoefer & Pan Y. (2007): A comparison of diatom assemblages generated by two sampling protocols. The North American Benthological Society.

Foto: Ameljåkkå Bart van de Vijver Swedish University of Agricultural Sciences www.slu.se