Presentation laddar. Vänta.

Presentation laddar. Vänta.

Ta bort laddningarna i proteinet S6 för att studera betydelsen av laddade aminosyror för proteinets veckning Kurnik et al PNAS 2012 S6 proteinet har 16.

Liknande presentationer


En presentation över ämnet: "Ta bort laddningarna i proteinet S6 för att studera betydelsen av laddade aminosyror för proteinets veckning Kurnik et al PNAS 2012 S6 proteinet har 16."— Presentationens avskrift:

1 Ta bort laddningarna i proteinet S6 för att studera betydelsen av laddade aminosyror för proteinets veckning Kurnik et al PNAS 2012 S6 proteinet har 16 negativt och 16 positivt laddade sidokedjor som utgör 32 % av aminosyrasekvensen Topologin för S6 2BXJ Frågeställning: Har laddade aminosyror en viktig roll i proteinveckningsprocessen för att t ex undvika oönskade interaktioner som leder till felaktiga strukturer?

2 S6 WT Inga mutationer S Lys och Arg är muterade till Ser S6 +1 Asp och Glu protoneras vid lågt pH. Kurnik et al PNAS 2012

3 Analys av strukturen för de olika proteinvarianterna mha NMR Ett HSQC experiment visar korstoppen mellan protonen och kvävet i amidgruppen hos de individuella aminosyrorna Slutsats: Båda varianterna (S samt S6 +1 ) har nativliknande struktur viktigt att veta för att studera proteinveckningen Kurnik et al PNAS 2012

4 Bestäm proteinstabiliteten för de tre S6 varianterna genom att bestämma hastighetskonstanten för folding (k f ) och unfolding (k u ) i olika [GdmCl] Hur gör man detta experiment? Plot av k f och k u mot [GdmCl] → Chevronplot GdmCl är ett salt som denaturerar proteiner Chevronplot Kurnik et al PNAS 2012

5 Konstruktion av chevronplot 1. Bestämning av hastighetskonstanten för unfolding k u vid olika [GdmCl] Nativt protein Späd till olika högre koncentrationer av GdmCl Denaturerat protein Mät spektroskopisk förändring över tid t ex fluorescence Time Fluorescence Unfolding: Fit single exp y = A + B*exp(k U *t) N U

6 Konstruktion av chevronplot 2. Bestämning av hastighetskonstanten för folding k f vid olika [GdmCl] Denaturerat protein Späd till olika lägre koncentrationer GdmCl Nativt protein Mät spektroskopisk förändring över tid t ex fluorescence Time Fluorescence Folding: Fit single exp y = A + B*exp(-k F *t) N U

7 Time Fluorescence Unfolding: Fit single exp y = A + B*exp(k U *t) Folding: Fit single exp y = A + B*exp(-k F *t) N U Chevron plot ln k osb [GdmCl] = lnk u H2O + m u [GdmCl] = lnk f H2O + m f [GdmCl] lnk F H2O lnk U H2O • • • • • • • • • Beräkna hastighetskonstanten för folding (k f ) och unfolding (k u ) i olika [GdmCl] MP = [GdmCl] då k u = k f → [N] = [D] MP = (lnk f H2O - lnk u H2O )/(m u – m f ) • m u lutningen på linjen lnk u vs [GdmCl] • m f lutningen på linjen lnk f vs [GdmCl]

8 ln k osb [GdmCl] = lnk u H2O + m u [GdmCl] = lnk f H2O + m f [GdmCl] lnk F H2O lnk U H2O • • • • • • • • • Chevron plot G D N Reaktions koordinat ΔG D-N = -RTlnk U H2O /k F H2O k F H2O k U H2O mfmf mumu m D-N = m u - m f • m u – förändring i exponerad yta mellan N och TS • m f – förändring i exponerad yta mellan D och TS • m D-N – förändring i exponerat yta mellan D och N TS (Transition state) Konstruera ett energidiagram ΔG H2O = -RTlnk U H2O /k F H2O Från m-värdena kan man beräkna β T som är ett mätvärde på exponerad yta i TS relativt D β T = -m f /m D-N = 1-m u /m D-N (ligger mellan 0-1) β T = 1 → TS har en kompakt N-liknande struktur β T = 0 → TS är ostrukturerad och liknar D

9 Kinetiska parametrar och proteinstabilitet från chevronplot S6 WT S S6 +1 Energidiagram relativt det denaturerade tillståndet D • Energinivån för N bestäms från ΔG D-N H2O • Höjden på aktiveringsbarriären bestäms från k f • Positionerna för D, TS och N längst reaktions koordinaten är bestämda från m-värderna och normaliserade till N Kurnik et al PNAS 2012 TS

10 Slutsats: • De laddade aminosyrorna har inte en avgörande roll i veckningsprocessen då proteinet kan vecka sig utan närvaro av laddningar. • Laddade aminosyror är viktiga för proteinets löslighet samt för interaktioner och för biologisk funktion (obs! slutsats från andra experiment i artikeln). • DVS Specificiteten i veckningsprocessen kontrolleras primärt av hydrofoba interaktioner och vätebindningar emedan laddningar hos proteinet är av betydelse för proteinets löslighet och bindningsegenskaper. Kurnik et al PNAS 2012 Med alla laddningar Utan laddningar Borttagning av laddningar leder till att proteinet veckar sig fortare (i.e. aktiveringsenergin sänks) men det nativa tillståndet destabiliseras. Frågeställning: Har laddade aminosyror en viktig roll i proteinveckningsprocessen för att t ex undvika oönskade interaktioner som leder till felaktiga strukturer?

11 Hur kan man detektera om en aminosyra har bildat sina nativa kontakter i TS? G D N Reaktions koordinat mfmf mumu m D-N = m u - m f TS Uppgift: Ta reda på i vilken utsträckning aminosyrorna grön, blå och lila har bildat nativa interaktioner i TS! Mutera bort en aminosyra i taget och gör en chevronplot

12 Chevron plot ln k osb • • • • • • • • • [GdmCl] • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • lnk F H2O lnk U H2O Beräkna Φ! Φ = (lnk f WT – lnk f mut ) (lnk f WT – lnk f mut ) - (lnk u WT – lnk u mut ) Φ (lila AA bortmuterad) = 0 (påverkar inte k f ) → Lila AA har inga nativa kontakter i TS Φ (blå AA bortmuterad) = 1 (k f är lägre, k u oförändrad)→ Blå AA har bildat alla nativa kontakter i TS Φ (grön AA bortmuterad) = mellan 0-1 (både k f och k u påverkas) → grön AA har bildat en del nativa kontakter i TS Vid en systematisk mutationsstudie kan man kartlägga vilka AA som har bildat struktur i TS! Fersht sid


Ladda ner ppt "Ta bort laddningarna i proteinet S6 för att studera betydelsen av laddade aminosyror för proteinets veckning Kurnik et al PNAS 2012 S6 proteinet har 16."

Liknande presentationer


Google-annonser