Kurnik et al PNAS 2012 Frågeställning: Har laddade aminosyror en viktig roll i proteinveckningsprocessen för att t ex undvika oönskade interaktioner som.

En presentation över ämnet: "Kurnik et al PNAS 2012 Frågeställning: Har laddade aminosyror en viktig roll i proteinveckningsprocessen för att t ex undvika oönskade interaktioner som."— Presentationens avskrift:

1 Kurnik et al PNAS 2012 Frågeställning: Har laddade aminosyror en viktig roll i proteinveckningsprocessen för att t ex undvika oönskade interaktioner som leder till felaktiga strukturer? Ta bort laddningarna i proteinet S6 för att studera betydelsen av laddade aminosyror för proteinets veckning Topologin för S6 2BXJ S6 proteinet har 16 negativt och 16 positivt laddade sidokedjor som utgör 32 % av aminosyrasekvensen

2 Lys och Arg är muterade till Ser
Kurnik et al PNAS 2012 S6WT Inga mutationer S6+1-17 Lys och Arg är muterade till Ser S6+1 Asp och Glu protoneras vid lågt pH.

3 viktigt att veta för att studera proteinveckningen
Kurnik et al PNAS 2012 Analys av strukturen för de olika proteinvarianterna mha NMR Ett HSQC experiment visar korstoppen mellan protonen och kvävet i amidgruppen hos de individuella aminosyrorna Slutsats: Båda varianterna (S samt S6+1 ) har nativliknande struktur viktigt att veta för att studera proteinveckningen

4 Plot av kf och ku mot [GdmCl] → Chevronplot
Kurnik et al PNAS 2012 Bestäm proteinstabiliteten för de tre S6 varianterna genom att bestämma hastighetskonstanten för folding (kf) och unfolding (ku) i olika [GdmCl] GdmCl är ett salt som denaturerar proteiner Chevronplot Plot av kf och ku mot [GdmCl] → Chevronplot Hur gör man detta experiment?

5 Konstruktion av chevronplot
1. Bestämning av hastighetskonstanten för unfolding ku vid olika [GdmCl] Späd till olika högre koncentrationer av GdmCl Denaturerat protein Nativt protein U Mät spektroskopisk förändring över tid t ex fluorescence Fluorescence N Time Unfolding: Fit single exp y = A + B*exp(kU*t)

6 Konstruktion av chevronplot
2. Bestämning av hastighetskonstanten för folding kf vid olika [GdmCl] Späd till olika lägre koncentrationer GdmCl Denaturerat protein Nativt protein U Fluorescence Mät spektroskopisk förändring över tid t ex fluorescence N Time Folding: Fit single exp y = A + B*exp(-kF*t)

7 Beräkna hastighetskonstanten för folding (kf) och unfolding (ku) i olika [GdmCl]
Unfolding: Fit single exp y = A + B*exp(kU*t) Fluorescence Folding: Fit single exp y = A + B*exp(-kF*t) N Time Chevron plot mu lutningen på linjen lnku vs [GdmCl] mf lutningen på linjen lnkf vs [GdmCl] lnkFH2O = lnkfH2O + mf [GdmCl] • • • • = lnkuH2O + mu [GdmCl] • • • • ln kosb • [GdmCl] MP = [GdmCl] då ku = kf → [N] = [D] MP = (lnkfH2O - lnkuH2O)/(mu – mf) lnkUH2O

8 G D N Reaktions koordinat Chevron plot lnkFH2O
• = lnkfH2O + mf [GdmCl] • • • = lnkuH2O + mu [GdmCl] • • ΔGH2O = -RTlnkUH2O/kFH2O • ln kosb • • [GdmCl] lnkUH2O Konstruera ett energidiagram TS (Transition state) kFH2O kUH2O mu – förändring i exponerad yta mellan N och TS mf – förändring i exponerad yta mellan D och TS mD-N – förändring i exponerat yta mellan D och N G D ΔGD-N = -RTlnkUH2O/kFH2O N Från m-värdena kan man beräkna βT som är ett mätvärde på exponerad yta i TS relativt D βT = -mf /mD-N = 1-mu/mD-N (ligger mellan 0-1) βT = 1 → TS har en kompakt N-liknande struktur βT = 0 → TS är ostrukturerad och liknar D mf mu mD-N = mu - mf Reaktions koordinat

9 Kurnik et al PNAS 2012 Kinetiska parametrar och proteinstabilitet från chevronplot S6WT S S6+1 TS Energidiagram relativt det denaturerade tillståndet D Energinivån för N bestäms från ΔGD-NH2O Höjden på aktiveringsbarriären bestäms från kf Positionerna för D, TS och N längst reaktions koordinaten är bestämda från m-värderna och normaliserade till N

10 Kurnik et al PNAS 2012 Borttagning av laddningar leder till att proteinet veckar sig fortare (i.e. aktiveringsenergin sänks) men det nativa tillståndet destabiliseras. Utan laddningar Med alla laddningar Frågeställning: Har laddade aminosyror en viktig roll i proteinveckningsprocessen för att t ex undvika oönskade interaktioner som leder till felaktiga strukturer? Slutsats: De laddade aminosyrorna har inte en avgörande roll i veckningsprocessen då proteinet kan vecka sig utan närvaro av laddningar. Laddade aminosyror är viktiga för proteinets löslighet samt för interaktioner och för biologisk funktion (obs! slutsats från andra experiment i artikeln). DVS Specificiteten i veckningsprocessen kontrolleras primärt av hydrofoba interaktioner och vätebindningar emedan laddningar hos proteinet är av betydelse för proteinets löslighet och bindningsegenskaper .

11 G D N Reaktions koordinat
Hur kan man detektera om en aminosyra har bildat sina nativa kontakter i TS? TS Uppgift: Ta reda på i vilken utsträckning aminosyrorna grön, blå och lila har bildat nativa interaktioner i TS! G D N mf mu mD-N = mu - mf Mutera bort en aminosyra i taget och gör en chevronplot Reaktions koordinat

12 Chevron plot lnkFH2O Beräkna Φ! ln kosb [GdmCl] lnkUH2O
Fersht sid Chevron plot lnkFH2O Beräkna Φ! • • • • • • • • • • • (lnkfWT – lnkfmut) • • • • • Φ = • • • • • • • ln kosb • • (lnkfWT – lnkfmut) - (lnkuWT – lnkumut) • • • • [GdmCl] lnkUH2O Φ (lila AA bortmuterad) = 0 (påverkar inte kf) → Lila AA har inga nativa kontakter i TS Φ (blå AA bortmuterad) = 1 (kf är lägre, ku oförändrad)→ Blå AA har bildat alla nativa kontakter i TS Φ (grön AA bortmuterad) = mellan 0-1 (både kf och ku påverkas) → grön AA har bildat en del nativa kontakter i TS Vid en systematisk mutationsstudie kan man kartlägga vilka AA som har bildat struktur i TS!