Metoder för att mäta lätta kedjor i urin och serum

En presentation över ämnet: "Metoder för att mäta lätta kedjor i urin och serum"— Presentationens avskrift:

1 Metoder för att mäta lätta kedjor i urin och serum
Fria lätta kedjor Anders Larsson

2 Myeloma Diagnostik (1 major+1 minor or 3 minor)
Major Kriterier Plasmacytom i biopsi 30% plasmaceller í märgen M-protein 35 g/L IgG 20 g/L IgA 1g/24 h urin Bence Jones Minor kriterier 10-29% plasmaceller i märgen M-protein Mindre än till vänster Skelettuppklarningar Sänkta Ig nivåer IgM <0,5 g/L IgA <1 g/L IgG <6 g/L 2

3

4 Structures of antibodies
4 IgG subklasser 2 IgA subklasser 1 IgM subklass (mono o pentamer) 1 IgD subklass 1 IgE subklass 2 lätta kedjor Kappa Lamda

5 Isotyper, Immunoglobulin

6 IgM och IgA molecyler, multimerer.

7

8 [Estimate]

9 Anti-kappa antikropp görs genom immunisering med ett antal renade kappakedjor (>3). Detta kallas för immunogen. En kappa kalibrator innehåller ett antal renade lätta kedjor eller polyklonalt IgG. Liknar kalibrator eller patientprov immunogenet får man en stark signal. Är likheten låg så får vi en svag signal. Olika kalibratorer i Sverige. Renade kedjor eller polyklonalt IgG,

10 För fria lätta kedjor desorberar man bort antikroppar som känner igen intakt antikropp tex med hjälp av IgG- sepharos. Innebär antikroppsförluster – högre pris Svårare att standardisera

11 Önskemål på en lätt kejde test:
Låg reaktivitet mot variabla regioner Samma reaktivitet mot olika typer av tung kedja. Detekterar även fragment av lätta kedjor. Alla kalibratorer skall vara lika. I plasma skall testet inte detektera intakt antikropp. Lätt kedja har en molekylvikt på 22 kDa. Fritt filtrerbar genom njuren. Återresorberas i tubuli.

12 Lätt kedje diagnostik / BenceJones proteinuri.
Definitionsmässigt är det en fri lätt kedja.

13 Bence Jones Protein Test
Principle. Bence-Jones protein is soluble in urine at room and body temperature. When the urine is heated to 40°C, a white cloud appears and at 60°C, a distinct precipitate forms. The precipitate disappears on boiling but reappears on cooling. Excessive amounts of acid or salt will prevent the appearance of the precipitate. Reagent. Acetic Acid, approximately 10% aqueous solution. Procedure. Add urine to a 6-inch test tube until it is about two-thirds full. Place in a water bath and heat slowly. Do not allow the bottom of the test tube to touch the bottom of the beaker, as it may become hotter than the rest of the water. Suspend a thermometer in the water bath. Note the temperature and the appearance of the urine every few minutes, especially between the temperatures of 40°C - 60°C. If a slight cloud appears when the urine is heated to the boiling point, 100°C, add a few drops of acetic acid. This will dissolve any phosphates that have separated out. If a precipitate forms at the boiling point, it is due to albumin. Boil the urine with a few drops of dilute acetic acid, filter rapidly, and repeat the test on the cooled filtrate.

14 Myeloma: Durie-Salmon Staging
Stage I Hemoglobin >10 g/dL Normal calcium No lytic bone lesions Low M-protein IgG <50 g/L IgA <30 g/L Bence Jones <4 g/24h Stage II (not Stage I/III) Stage III Hemoglobin <8.5 Calcium >12 (adjusted) >3 lytic bone lesions High M-protein IgG >70 g/L IgA >50 g/L Bence Jones >12 g/24h A) Creatinine <2 B) Creatinine >2 14

15

16 Analys av lätta kedjor Påvisande av Bence Jones proteinuri Typning av M-komponenter Tubuliskador och akut njursvikt

17 Påvisande av Bence Jones proteinuri
Agaros elfores –både lätt och tung kedja Kvantifiering av lätta kedjor urin (bunden och fri) Fria lätta kedjor Jag prioriterar stabilitet i kvantifiering över tid!

18 Typning av M-komponenter
Immunfixation – både lätt och tung kedja Kvantifiering av lätta kedjor i urin (bunden och fri) + tung kedja i plasma. Fria lätta kedjor + tung kedja i plasma Snabbare och billigare om vi slipper begära urin??

19 Tubuliskador och akut njursvikt
Skadan beror på fria kedjor urinen. Bör vara lätta kedje analys Kräver dagliga analyser under 3-5 dagar för att styra behandlingen.

20 Lätta kedjor (fri + bunden)
Varje patient är unik. Stora skillnader mellan individer Överensstämmelse mellan leverantörer för samma patient Dålig! TotalCV inom Sverige ca 35%. Kommer troligen ej förbättras Överensstämmelse över tid för samma leverantör Osäkert hur stor batchskillnaden är

21 Fria Lätta kedjor Stora förhoppningar om god överensstämmelse då det bara var en leverantör Nu är det 2 leverantörer Varje patient är unik. Stora skillnader mellan individer Överensstämmelse mellan leverantörer för samma patient Troligen dålig! Överensstämmelse över tid för samma leverantör Verkar vara hög, men svårt att veta om någon är bättre Reagensen dyra – Måste tillföra något i diagnostiken!

22 Binding Site, 2007

23 Binding Site, 2007

24 Binding Site, 2007 Samma prover på Immage 2/20 prover falskt låga

25 Binding Site- Siemens, 2012

26 Binding Site- Siemens, 2012

27 Binding Site- Siemens, 2012

28 Binding Site- Siemens, 2012

29 Fria Lätta kedjor Binding Site eller Siemens?? Priset ungefär lika mellan leverantörerna. Binding Site har längre erfarenhet och är fokuserade på lätta kedjor. Gjort utveckling i flera steg för att minska skillnader i utslag mellan olika lätta kedjor. Monoklonal antikropp. Batch till batch skillnader. Siemens nyare. Kortare erfarenhet av fria lätta kedjor men lång erfarenhet av andra immunoassays än fria lätta kedjor. Dedicerade instrument. Stark organisation/stora resurser. Batch till batch skillnader? Uppsala kör Binding Site på Cobas. Rätt val??

30 Frågor?