Polymerase Chain Reaction

En presentation över ämnet: "Polymerase Chain Reaction"— Presentationens avskrift:

1 Polymerase Chain Reaction
Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell

2 Polymerase Chain Reaction
Kary Mullis f.1944 Presenterade PCR i Science 1985 Nobelpriset i kemi 1993 Kary mullis

3 Vad är PCR? Kopieringsmaskin för DNA?
Kan påvisa att ett prov innehåller en viss gen

4 Varför var PCR revolutionerande?
Kan kopiera EN SPECIFIK DNA-sekvens bland tusen andra gener Snabb (jämfört med genkloning) Känslig kan detektera DNA från enstaka celler Robust kan detektera DNA från fossila prover

5 Repetition: syntes av ny sträng
Templat: ssDNA som fungerar som mall för den nya strängen Primer: för att starta DNA-syntesen Nukleotider(dNTP´s): utgör ”byggstenar” i DNA DNA-polymeras: enzym som bildar fosfodiesterbindning mellan 5´P och 3´OH

6 Vad behöver man i röret? Templat (prov med DNA)
Forward primer (startsekvens) Reverse primer (startsekvens) dNTP´s (byggstenar) Taq DNA polymeras Buffert, salter Primers Nukleotider DNA Salt Polymeras Buffer

7 Vad händer i röret? Tre steg: Denaturering 95oC Annealing av primers
Syntes av ny sträng 72oC Detta upprepas ggr

8 Två primers behövs Forward primer Reverse primer Syntes ”in mot genen”
DNA templat 3’ 5’ Taq Riktning på extension 5’ Taq 3’ reverse Primer 5’ 5’ forward Primer Riktning på extension 5’ 3’ Forward primer Hybridiserar uppströms om genen Reverse primer Hybridiserar nedströms om genen Syntes ”in mot genen”

9 Taq DNA polymeras Värmestabilt Optimalt vid 72 °C
Adderar nukleotider komplementära till templatsträngen Dubbelsträngad DNA bildas Syntes från 5´till 3´

10 Amplifiering av målsekvens!
Nästa bild: fig. 1 gå igenom tre cykler.

11 Resultat Området mellan primrarna; målområdet, ”target” amplifieras exponentiellt x2 x2 x2 x2 osv…. Efter 30 cykler har man fått ca 1 x 109 kopior av målområdet

12 Detektion av PCR-produkt
Gelelektrofores Separation av DNA Färgning av DNA Alt: Realtids- PCR

13 Vad betyder ett band i gelen
Det har bildats DNA-molekyler vid PCR-reaktionen. Primrarna måste ha bundit till DNA i provet Det finns sekvenser som är komplementära till primrarna Slutsats: Vi har påvisat att vårt mål-DNA fanns i provet

14 Tillämpningar Diagnos av bakt/virusinfektion Rättskemiska analyser
Diagnos av ärftliga sjukdomar Sekvensering Kloning Kvantifiering av genuttryck (RT-PCR) Med mera!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

15 Begränsningar? Man måste känna till sekvensen på båda sidor om den DNA-sekvens man vill amplifiera Kan ej amplifiera långa gener

16 Problem vid PCR Ospecifika produkter Kontamination Inhibition

17 Optimering av PCR-reaktion
Val av primerpar Annealingtemperaturen (beror på primers) Mg2+-koncentration

18 Ospecifika produkter Vad har hänt? Hur kan det bildas flera produkter?

19 Primerlängd 8-mer ger statistiskt möjliga sekvenser att hybridisera till i humana genomet 17-mer har 1 chans på bp att slumpmässigt hitta en komplementär sekvens Fig Brown Gene Cloning

20 Kontamination ”Carry-over” kontamination från ett amplifierat positivt prov till ett nytt prov En aerosoldroppe kan innehålla 500 kopior av målområdet Efter amplifiering har man fått miljoner kopior; falskt positivt prov För att upptäcka ev. kontaminering körs en negativ kontroll (utan templat DNA) Positivt prov Negativt prov kontamination

21 Separata rum DNA extraktion prePCR rum (renrum) PCR rum

22 Inhibering Rester från prov eller DNA-extraktion kan inhibera PCR-reaktionen Risk för falskt negativa prov Intern kontroll tillsätts, om den inte amplifieras tyder det på inhibering PCR-film

23 Brister med traditionell PCR
Separata steg för amplifiering och detektion; risk för kontaminering Långsam, svår att automatisera Mäter vid slutpunkt; osäker kvantif. Svårt att jämföra effektivitet vid olika PCR-reaktioner

24 Realtids-PCR Mha fluorescerande molekyler kan man detektera PCR-produkter varje cykel Mätning av PCR-produkter under den exponentiella fasen ger ett säkrare värde än mätning efter att alla cykler körts (end point)

25 End point/Real time Konventionell PCR Realtidsmätning
Analyserar produkten vid slutpunkt Realtidsmätning Bildad produkt detekteras med fluorimeter Mäter PCR-produkt vid varje cykel lc_principles/lc_principles_ind.htm

26 CT = Cykel vid tröskelvärde
Exponentiell fas. Varje cykel: 2x DNA Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden CT=den cykel när signalen passerar ”tröskeln” Ju mer mål-DNA desto lägre CT (BioRad)

27 Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering
96 replikat av identisk reaktion Slutlig mängd varierar VARFÖR? Tröskelvärde (CT) varierar inte (Fig från BioRad)

28 Realtids-PCR iCycler BioRad, mikrotiterplattor LightCycler Roche,
kapillärer Nov 2005 Eppendorf lanserar Mastercykler ep realplex ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor

29 Realtids-PCR Fördelar Lättare att undvika kontamination
Behöver ej öppna röret för detektion Säkrare kvantifiering av mål-DNA

30 Realtids-PCR Tillämpningar Kvantitativ analys (Q-PCR)
Ex. jmf mRNA i olika celler Multiplex PCR (flera primerpar ger flera olika PCR-produkter) Ex. detektera flera virustyper i samma prov Detektion av mutationer (med FRETprober och smältkurvsanalys)

31 Spel http://nobelprize.org/educational_games/chemistry/pcr/index.html
72

32 Länkar http://www.biointeractive.org/vlabs/index.html
Gör en virtuell PCR: Gå in på nedanstående länk, Välj The Bacterial Identification Lab, Öppna dörren till labbet och kör en PCR!